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Anticorps d'épuration utilisant Ion Exchange Chromatography

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La chromatographie d'échange ionique (le CEI) est une méthode chromatographique employée pour séparer les composés biologiques. La base de la séparation dans le CEI est adsorption réversible (absorption extérieure) des molécules chargées sur une phase stationnaire.

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La phase stationnaire est faite de groupes d'échange ionique immobilisés qui ont la charge opposée comme composant de cible qui doit être porté dans la phase mobile. Généralement, des expériences d'échange ionique sont exécutées dans cinq étapes.

Quel est le CEI et comment il est exécuté ?

La première phase du CEI s'appelle l'équilibration. Pendant ce processus, la phase stationnaire d'échange ionique est équilibrée pour s'assurer qu'elle fonctionne aux conditions de pH optimisé et de concentration ionique pour maximiser l'adsorption du composant polaire de cible de la phase stationnaire.

La surface d'échange est une résine qui comporte une matrice des groupes fonctionnels ou des ligands ionisables chargés. Cette phase stationnaire montre ces groupes fonctionnels qui forment des interactions ioniques avec l'ion d'analyte de la charge de opposition. Il est important de maintenir l'electroneutrality, qui est l'état dans lequel la charge nette du système est zéro. Counterions sont présent dans la solution d'équilibration.

Dans la seconde étape, le présent polaire d'analyte de cible pendant la phase mobile d'échantillon doit concurrencer des counterions pour l'adsorption à la phase mobile. Ce résultats de processus dans le déplacement de counterion ; tous composants qui ne peuvent pas lier le passage par la colonne et sont immédiatement élués.

Pendant la troisième phase, la désorption des analytes attachées se produit. Ceci est réalisé en changeant les conditions obligatoires, principalement en changeant le pH ou en augmentant la concentration ionique du tampon d'élution.

Dans la dernière méthode, un tampon d'élution de concentration croissante en sel est appliqué à la colonne et des analytes sont libérées de la résine par ordre force obligatoire croissante. Ceci se produit parce que la concentration de counterion augmente et concurrence des analytes attachées. Les analytes mal obligatoires sont sorties d'abord, tandis que ces analytes capables de la liaison ionique forte sont dernières élué.

Le du quatrième étage est classé par catégorie vers la fin de la désorption, et dans le cinquième et la phase finale, la colonne est régénérée. La régénération remet à zéro la colonne ainsi elle peut être employée pour une autre purification. La séparation des analytes polaires dans un mélange complexe est possible parce que leurs différences dans la charge nette, la densité de charge, et la distribution de charge tient compte de l'interaction différentielle avec la surface d'échange ionique stationnaire. La dynamique de leur interaction avec la surface d'échange ionique peut être manoeuvrée en variant la concentration ionique et le pH de la phase mobile pendant l'élution.

Les propriétés de charge des molécules biologiques sont notables ; la chromatographie d'échange ionique est avantageuse en séparant des protéines, car elle fournit la séparation à haute résolution entre les protéines qui diffèrent seulement par un acide aminé simple.

séparation basée sur CEI d'anticorps

Il y a plusieurs processus chromatographiques qui facilitent l'isolement des anticorps en tirant profit de différentes propriétés biochimiques. La séparation basée sur la taille, le hydrophobicity, la solubilité, et l'affinité d'obligatoire sont des exemples qui ont été employés. D'une manière primordiale, les diverses propriétés de charge des anticorps les rendent favorables à la purification par le CEI ;

Les anticorps sont les molécules biologiques protéineuses, et leurs protéines de charge peuvent être manoeuvrées utilisant le CEI. La charge nette des molécules d'intérêt détermine le type de CEI qui peut être employé. Si franchement - les composés chargés sont la cible à capturer par la phase mobile, une résine d'échange cationique est choisis. Réciproquement, franchement - a chargé la résine d'échange anionique est choisi quand négativement - des molécules chargées doivent être immobilisées.

Les résines les plus communes utilisées dans des protocoles de purification d'anticorps sont des perles d'agarose de la protéine A. Il y a un grand choix d'autres résines disponibles dans le commerce qui peuvent être employées, cependant. La capacité de liaison de la résine, ainsi que la longueur de la colonne, détermine le nombre de cycles du CEI qui doivent être entrepris pour traiter les anticorps qui sont rapportés du surnageant des cellules machinées pour exprimer des quantités élevées de l'anticorps désiré.

On a rapporté que des résines d'échange cationique produisent les rendements élevés et réduisent la quantité de protéine de cellule hôte (HCP) ; HCPs sont des impuretés liées au processus qui sont dérivées de la cellule hôte de l'expression des protéines de recombinaison et biotherapeutic, telles que des anticorps. En plus, le processus est fortement sélectif, une telle cette attache est spécifique à la région constante des anticorps.

Les anticorps deviennent de plus en plus répandus en tant qu'agents thérapeutiques dans le traitement des diverses maladies comme l'arthrite et le cancer. En conséquence, la valeur marchande des anticorps augmente. Les anticorps monoclonaux (MAb) sont produits par les cellules mammifères et possèdent la même structure. La pureté de ces populations clonales est essentielle pour l'efficacité clinique.

Les titres de MAb sont en général aussi haut que 5 à 10 g/l, mais leur purification en aval crée un goulot d'étranglement dans leur production finale. Le CEI fournit une méthode par laquelle des anticorps peuvent être purifiés avec le rendement et la sélectivité élevés.