Test de cicatrisation - quoi, pourquoi et comment - Emmasingel 33, 5611 AZ Eindhoven, Netherlands

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L'essai de cicatrisation, également connu sous le nom d'essai de grattage, est une technique bidimensionnelle établie (2D) qui peut être utilisée pour étudier la migration collective et la cicatrisation des plaies in vitro [1], [2]. Cette méthode a été l'une des premières à être développée pour l'étude de la migration cellulaire et mesure la vitesse à laquelle les cellules, dans une monocouche cellulaire, migrent pour combler un vide cellulaire [1], [3]. Les essais de cicatrisation en trois dimensions (3D) dépassent le cadre de cet article et ont été brièvement couverts par Stamm et al. 2016 [2].

L'essai de cicatrisation est une méthode simple et peu coûteuse. Bien que cet essai ne récapitule pas les conditions exactes d'une plaie, il peut être appliqué avec succès pour modéliser et étudier le mouvement des cellules dans un environnement in vitro contrôlé. La technique reproduit la blessure en créant un espace dans une monocouche de cellules confluentes, et consiste en quatre étapes principales qui seront élaborées ci-dessous (voir la figure 1 pour une vue d'ensemble) [1].

La première étape de l'essai consiste à cultiver une monocouche de cellules confluentes. Cette monocouche représente les conditions in vivo du tissu avant la blessure, par exemple un épithélium intact. Le plus souvent, des cellules épithéliales et endothéliales sont utilisées pour produire la monocouche, et en particulier des types de cellules capables de migrer en feuillets [4]. Des études ont également examiné la migration des cellules musculaires lisses vasculaires [5], [6].

Selon le type de cellule utilisé dans l'essai, la prolifération cellulaire peut être un facteur de confusion. La prolifération cellulaire peut entrer en compétition avec la migration cellulaire pour combler le vide créé lors de l'essai. Si cela se produit, le milieu cellulaire peut être optimisé pour réduire la prolifération cellulaire. La diminution de la concentration de sérum (privation de sérum) est le changement le plus courant. Des inhibiteurs de prolifération, comme la mitomycine C, peuvent également être ajoutés au milieu. Une optimisation minutieuse est nécessaire car toute modification du milieu peut entraîner des effets imprévisibles dépendant du temps et du type de cellule qui peuvent interférer dans le test [1].

Une fois que les cellules sont devenues confluentes, l'étape suivante consiste à créer un espace sans cellule dans la monocouche. La méthode la plus fréquemment utilisée consiste à enrouler la monocouche par grattage mécanique (blessure par rayure) ou par estampage. Les alternatives aux dommages mécaniques peuvent inclure des blessures thermiques, électriques et optiques [2], [7]. Dans les essais de cicatrisation microfluidique, des traitements chimiques et enzymatiques ont été utilisés pour éliminer les cellules des canaux de fluide [5], [6], [8], [9]. Des méthodes qui évitent complètement les dommages cellulaires, telles que l'exclusion physique, ont également été décrites [4], [10].

La préparation des lacunes peut être effectuée manuellement ou être automatisée. Les inconvénients de la méthode manuelle sont le faible débit et la variation de la largeur de la fente d'un puits à l'autre [1], [11]. Cette reproductibilité peut être améliorée par l'utilisation d'outils commerciaux permettant de réaliser des espaces uniformes [1]. Les modifications apportées à l'essai de cicatrisation qui font appel à l'automatisation peuvent à la fois augmenter le débit et améliorer la reproductibilité [2], [7]. Il est important de garantir la reproductibilité pour l'étape suivante d'acquisition des données.

En préparant un espace sans cellules, la microscopie optique peut être utilisée pour observer les cellules migrant dans la zone de la plaie. La migration des cellules est mieux observée en utilisant l'imagerie à contraste de phase plutôt que la fluorescence, et la zone de la plaie dans le champ de vision doit être maximisée en utilisant la lentille de l'objectif [12] [13].

Une fois le microscope installé, une série d'images en temps réel (méthode de l'instantané) peut être acquise au fur et à mesure que les cellules migrent dans l'espace sans cellule [1]. Ces points temporels doivent être recueillis dans les 24 heures suivant le début de l'expérience afin de minimiser les effets confondants de la réplication des cellules sur la fermeture de l'espace. Les images de migration peuvent ensuite être utilisées pour collecter des mesures ou être notées visuellement [4]. Des mesures précises peuvent être acquises manuellement à l'aide d'une caméra numérique montée sur le microscope ; cependant, ce processus prend du temps et il peut être difficile de maintenir le même champ de vision le long de chaque trou [4].

Les inconvénients de l'acquisition manuelle peuvent être largement surmontés grâce à l'automatisation qui permet l'imagerie de cellules vivantes. Les aspects de l'acquisition qui peuvent être automatisés comprennent : la capture d'images, la visite de points et le contrôle de l'environnement [2], [4]. L'automatisation a également une plus grande fonctionnalité ; par exemple, elle peut être utilisée pour déterminer les paramètres expérimentaux et générer des mesures cinétiques, fonctionnelles et quantitatives des cellules vivantes (voir figure 2) [1].

Des systèmes d'imagerie de puits entier peuvent être appliqués à l'essai de cicatrisation. Pour les chercheurs intéressés par une telle fonctionnalité, voir la page d'accueil de CytomSMART Omni. Ce système d'imagerie de cellules vivantes fonctionne à partir d'incubateurs de culture cellulaire et est entièrement automatisé, afin de créer facilement des vidéos en temps réel de la fermeture des lacunes.

Une fois que des images de la réduction de l'écart ont été acquises, plusieurs méthodes d'analyse peuvent être utilisées pour quantifier le taux de migration des cellules. La première méthode mesure l'évolution de la largeur de la plaie (en nanomètres) dans le temps. Cette largeur est la distance moyenne entre les deux marges de la rayure. La deuxième méthode calcule la variation de la surface de la plaie au fil du temps en pourcentage de la fermeture de la plaie. Ces deux méthodes peuvent prendre beaucoup de temps lorsqu'elles sont effectuées manuellement. La dernière méthode mesure la densité relative de la plaie au fil du temps, exprimée en pourcentage, et est le plus souvent appliquée dans les logiciels d'imagerie à cellules vivantes [1], [12]. Cette méthode calcule le rapport entre la surface occupée dans l'espace et la surface totale de l'espace initial. La méthode de la densité relative de la plaie peut être affinée pour tenir compte de la prolifération des cellules ou des effets pharmacologiques. Cela peut être réalisé en comptant les cellules dans les sous-régions situées à l'intérieur et à l'extérieur de la plaie pour déterminer la densité cellulaire relative [12]. Le comptage des cellules totales dans la zone de la plaie peut également être utilisé pour évaluer la migration des cellules et la guérison de la plaie [2].

En plus de mesurer les changements dans la zone de la plaie, l'essai de cicatrisation peut également être appliqué pour suivre le mouvement des cellules individuelles sur le bord avant de la plaie. Cela permet aux chercheurs de comprendre le rôle des gènes dans la régulation de la migration des cellules [3].

La plupart des essais de cicatrisation utilisent encore en partie l'acquisition et l'analyse manuelles des données. L'extraction manuelle des données est très longue, subjective et sujette à erreur. Par conséquent, l'analyse de grands ensembles de données reste un goulot d'étranglement avec de nombreux essais. De plus, la multitude d'analyses disponibles rend difficile la comparaison entre les expériences [2]. Des logiciels d'analyse de données automatisés, tels que TScratch et ImageJ, ont été développés et peuvent accélérer considérablement l'analyse et surmonter les limitations liées à la qualité des images [14], [15].

Le test de cicatrisation est utilisé pour étudier la migration des cellules et la cicatrisation des plaies. La migration cellulaire est le déplacement de cellules individuelles, de feuillets cellulaires et de groupes de cellules d'un endroit à un autre. Deux types principaux ont été identifiés, à savoir la migration de cellules individuelles et la migration de cellules collectives. Cette dernière est définie par Grada et al. (2016) comme le mouvement coordonné d'un groupe de cellules qui maintient ses connexions intercellulaires et sa polarité collective [1].

La migration collective peut prendre deux formes différentes selon la matrice extracellulaire. La migration collective tridimensionnelle a lieu sur un échafaudage de tissus, et c'est le mouvement des cellules organisées en un réseau multicellulaire de brins. La migration collective bidimensionnelle (2D) (migration de feuille) a lieu sur la surface d'un tissu, et c'est le mouvement de feuilles monocouches plates. La cicatrisation des plaies est un exemple de migration de feuille [1].

Pour les chercheurs qui cherchent à évaluer les schémas de migration d'une seule cellule, nous recommandons le kit CytoSMART Lux2 Duo. Ce mini-système d'imagerie de cellules vivantes fonctionne à l'intérieur des incubateurs de culture cellulaire et permet de comparer côte à côte les cultures cellulaires.

Quatre processus se produisent au cours de la cicatrisation, à savoir l'hémostase, l'inflammation, la migration-prolifération et la maturation-remodelage [1], [2]. Lors de la blessure et sous l'influence des facteurs de croissance et des cytokines, les kératinocytes situés à l'arrière du bord de la plaie commencent à proliférer et à migrer vers le lit de la plaie. Ce processus implique la migration, la prolifération et la différenciation des cellules [1].

L'essai de cicatrisation est une méthode pratique et économique pour étudier la migration cellulaire collective dans différentes conditions expérimentales. Comme la migration cellulaire collective est liée à de nombreux processus physiologiques et pathologiques liés à l'embryogenèse, à la réparation des plaies et aux métastases du cancer, le test de cicatrisation est largement applicable [4], [8]. Le test peut être utilisé pour étudier les effets de l'interaction cellule-matrice et cellule-cellule sur la migration cellulaire, et être combiné avec la transfection pour déterminer l'effet de l'expression de gènes exogènes sur la migration de cellules individuelles [1], [3].

L'essai est également extensible, permettant le criblage à haut débit des gènes impliqués dans la migration des cellules cancéreuses, la découverte de petites molécules et la découverte de médicaments [1], [2], [16]. Des exemples de certaines de ces applications sont présentés ci-dessous.

Un essai de cicatrisation microfluidique a été mis au point par Wei et al. (2015) pour étudier la migration des cellules musculaires lisses vasculaires. La migration de ces cellules après une lésion endothéliale est un facteur inhérent à la progression de l'athérosclérose et aux complications associées à l'hyperplasie de l'intima [6]. Ces deux maladies sont une cause majeure de morbidité et de mortalité à l'échelle mondiale [17]. La compréhension des processus impliqués dans cette migration peut fournir des cibles potentielles pour l'inhibition. Ce test de cicatrisation modifié est une représentation plus proche du microenvironnement présent dans le système vasculaire. Dans l'étude, le test de cicatrisation microfluidique utilise cinq types de VSMC [6].

L'essai de cicatrisation peut être utilisé pour l'étude des pansements. Alves et al. (2020) ont utilisé l'essai pour étudier de nouveaux mélanges d'hydrogel comme pansement potentiel pour les plaies. L'effet de l'hydrogel sur la fermeture de la plaie a été évalué en l'incorporant dans le milieu cellulaire. Les auteurs ont démontré que les hydrogels pouvaient être utilisés pour améliorer le processus de cicatrisation des plaies en favorisant la migration, l'adhésion et la prolifération des fibroblastes [18].

Les inhibiteurs de l'invasion cellulaire et des métastases peuvent être efficacement testés à l'aide du test de cicatrisation. Wang et al. ont examiné avec succès la capacité des alcaloïdes cytotoxiques à inhiber les processus biologiques liés à la migration cellulaire et à la dynamique du cytosquelette. L'étude a permis d'identifier certains alcaloïdes cytotoxiques comme des agents anti-migrants qui pourraient être étudiés plus avant [19].

J'ai une formation en sciences de la vie avec un doctorat en biologie moléculaire et cellulaire. Mon doctorat a porté sur un virus animal afin de comprendre sa génétique et de développer un candidat vaccin. Mes travaux se sont concentrés sur le développement de vaccins à sous-unités pour arrêter les virus qui affectent notre santé et ont un impact sur notre économie. Il s'agit notamment du VIH, du papillomavirus humain (qui provoque le cancer du col de l'utérus) et des virus qui infectent les ovins et les porcins.

12] S. T. Johnston, E. T. Shah, L. K. Chopin, D. L. S. McElwain, et M. J. Simpson, "Estimation de la diffusivité cellulaire et du taux de prolifération cellulaire par l'interprétation des données du test IncuCyte ZOOMTM en utilisant le modèle Fisher-Kolmogorov", BMC Syst. Biol. vol. 9, no. 1, p. 38, 2015.

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