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Une nouvelle méthode pour imager des échantillons épais

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Supprimer le flou de l'image sans passer au confocal

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Contenu sponsorisé : Les microscopes à fluorescence à grand champ (WF) fournissent une imagerie à haute résolution pour les échantillons fins, mais leur capacité à imager des échantillons plus épais est limitée en raison de la fluorescence de fond qui rend l'image floue. Le sectionnement optique permet de résoudre efficacement ce problème, mais nécessite traditionnellement un système confocal ou un logiciel de débrouillage. Grâce à la technologie de sectionnement optique qui équipe désormais les scanners de diapositives, les chercheurs peuvent bénéficier des capacités confocales pour l'imagerie d'échantillons épais, avec un débit nettement amélioré.

Limites de l'imagerie à grand champ

La microscopie à champ large est une technique d'imagerie omniprésente qui est très efficace pour les échantillons minces (<10 µm). En microscopie WF, la lumière provenant des plans de mise au point et hors mise au point est recueillie par la caméra, ce qui ne pose pas de problème pour les échantillons minces. Lors de l'imagerie d'échantillons plus épais, cette fluorescence de fond inévitable provoque un flou de l'image et un faible contraste, masquant les structures d'intérêt. La microscopie confocale et d'autres techniques d'illumination par balayage permettent de résoudre ce problème. Elles fonctionnent en façonnant l'illumination selon un modèle fixe, ce qui permet d'obtenir une image optiquement sectionnée. Ces systèmes peuvent produire d'excellentes images dans des conditions favorables. Cependant, ils sont très coûteux et dépendent de l'apport de modèles d'illumination bien définis et contrôlés dans l'échantillon.

Une nouvelle approche de l'éclairage

Pour annuler les effets de la fluorescence de fond sur le contraste et la qualité de l'image, il n'est pas toujours nécessaire de disposer de schémas d'illumination bien définis et contrôlés. Une technique connue sous le nom de microscopie HILO utilise des motifs de chatoiement aléatoires pour éclairer l'échantillon fluorescent. Les motifs de chatoiement présentent une intensité granulaire avec un contraste intrinsèquement élevé, ce qui donne un aspect granulaire aux images de fluorescence obtenues par l'éclairage de chatoiement. Cette granularité fournit un contraste et une indication directe du degré de mise au point de l'échantillon.

Pendant l'imagerie HILO, deux images brutes sont collectées et traitées. La première est une image WF régulière avec un éclairage uniforme. Un filtre passe-haut est appliqué à cette image pour extraire les informations à haute fréquence - la partie "HI" de la microscopie HILO. Cette étape permet d'éliminer les informations à basse fréquence, y compris les informations de mise au point et hors mise au point. La seconde image est capturée à l'aide de l'illumination speckle pour récupérer les informations de basse fréquence de l'image in-focus - la partie "LO" de la microscopie HILO. Ces images sont traitées à l'aide d'un algorithme qui extrait les informations de mise au point et élimine la fluorescence de fond. Les deux images sont ensuite fusionnées (figure 1) pour obtenir une image contenant des informations sur toute la gamme de fréquences, la lumière hors foyer étant éliminée.

Le dispositif de coupe optique SILA est une solution d'imagerie à haut débit pour les scanners de lames de recherche Slideview VS200 basés sur la microscopie HILO. Il s'agit d'une technologie complémentaire pour les microscopes à champ large (WF) qui élimine la lumière hors foyer et produit des coupes optiques nettes équivalentes à celles de la microscopie confocale. Le dispositif SILA peut être facilement ajouté à n'importe quel système VS200 et apporte des avantages à une large gamme d'applications nécessitant l'imagerie optique de haute qualité d'échantillons plus épais.

Sectionnement optique réglable

Comme le dispositif SILA traite mathématiquement l'image WF traditionnelle et l'image de speckle, il est possible d'ajuster le degré de sectionnement optique à l'aide d'un seul paramètre, que nous appelons épaisseur de sectionnement (ST). Lorsque l'épaisseur de sectionnement est élevée, les images affichent des informations provenant d'une plus grande profondeur de champ, ce qui donne l'apparence d'une image WF.

La figure 2 montre une coupe de cerveau prise à ST5. À cette valeur élevée du ST, de nombreuses zones non focalisées subsistent. Au fur et à mesure que la valeur ST diminue, l'image affiche des informations provenant d'une plus petite profondeur de champ. Par conséquent, lorsque l'on observe la coupe de cerveau prise à ST2 et ST1, l'information focalisée demeure alors que les éléments non focalisés ont disparu. La possibilité d'optimiser la coupe optique de cette manière permet de visualiser à différentes profondeurs tout en éliminant la fluorescence de fond. Cette caractéristique du dispositif SILA pour le scanner VS200 est comparable aux systèmes de microscopie confocale, dans lesquels la modification de la taille du trou d'épingle permet d'obtenir un effet similaire.

Capacités de déconvolution

Avant le développement du dispositif SILA, les scanners VS200 disposaient d'une solution alternative pour supprimer la lumière hors foyer des images WF. Le logiciel de déconvolution Trusight permet de déconvoluer les images à l'aide d'algorithmes itératifs contraints en 2D (CI). Cette approche logicielle permet d'éliminer efficacement une partie de la lumière hors foyer. Cependant, elle ne permet pas d'éliminer autant de lumière hors foyer ni d'optimiser le sectionnement optique que le logiciel et le matériel combinés utilisés dans le module SILA. Cependant, la déconvolution constitue une option intermédiaire viable pour l'observation d'échantillons plus fins lorsque le sectionnement optique SILA n'est pas disponible. Les différences de qualité d'image entre les images WF conventionnelles, les images déconvoluées par logiciel et les images SILA sont illustrées dans la figure 3.

Applications de l'imagerie SILA

La technologie de coupe optique SILA peut apporter une valeur significative à de nombreuses applications de recherche, en particulier dans l'imagerie de couches cellulaires épaisses et fixes et d'échantillons de tissus. Avec des fonctions d'optimisation du sectionnement, une élimination du flou et un contraste d'image comparables à ceux des microscopes confocaux, SILA fournit une imagerie de haute qualité avec un débit nettement amélioré.

La possibilité d'imager des échantillons plus épais est bénéfique pour l'imagerie des neurosciences, où des coupes de tissus épaisses sont souvent nécessaires pour préserver la morphologie de l'échantillon. L'imagerie de coupes de cerveau est notoirement difficile. Elle est particulièrement difficile en raison de la propension du tissu cérébral à produire un effet de diffusion de la lumière. Traditionnellement, des systèmes de microscopie confocale ou à deux photons sont nécessaires pour capturer une image de haute qualité et à fort contraste, mais ces systèmes prennent beaucoup de temps pour imager une grande zone telle qu'une section de cerveau. Le balayage automatisé des lames fourni par le système VS200 avec le dispositif SILA permet d'imager des échantillons épais sur une grande surface beaucoup plus rapidement, fournissant des images de haute qualité en une fraction du temps (Figure 4).

La recherche sur les organoïdes est un autre domaine qui bénéficie de l'imagerie SILA, car l'imagerie des organoïdes présente des défis similaires à ceux des neurosciences. L'imagerie des organoïdes est difficile en raison de l'épaisseur des échantillons, tandis que de grandes zones doivent être imagées pour que la morphologie des organoïdes puisse être correctement étudiée. En tant que scanner de lames entières, le système VS200 avec le module SILA peut fournir la couverture nécessaire à l'imagerie de ces grands échantillons. Par ailleurs, son traitement automatisé de l'image, sa fonction d'étalement du point (PSF) indépendante de l'échantillon et son flux de travail simple permettent une acquisition rapide des images. Le dispositif SILA apporte également une valeur ajoutée à la recherche sur le cancer, à la biologie spatiale, à la botanique, à l'embryologie et à bien d'autres domaines qui nécessitent une imagerie de haute qualité d'échantillons épais sur de grandes surfaces.

Résumé

L'imagerie SILA permet d'optimiser le sectionnement optique, de réduire le flou de l'échantillon et d'améliorer le contraste de l'image de manière comparable aux microscopes confocaux à balayage laser sophistiqués. Offrant un débit nettement supérieur à celui des systèmes confocaux, le scanner de lames VS200 avec le dispositif SILA permet l'imagerie rapide d'échantillons de grande taille et traditionnellement difficiles à imager, apportant des avantages significatifs aux neurosciences, à la recherche sur les organoïdes et à bien d'autres domaines.