Les méthodes basées sur la PCR mènent les efforts de diagnostic de la COVID-19

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En décembre 2019, plusieurs cas de pneumonie atypique ont été signalés dans la ville de Wuhan en Chine. Les tests de laboratoire ont confirmé que l'agent pathogène en cause était un nouveau coronavirus, provisoirement nommé 2019-nCoV et désormais appelé SRAS-CoV-2. Le SRAS-CoV-2 est à l'origine de la maladie officiellement désignée comme COVID-19 par l'Organisation mondiale de la santé (OMS). En date du 27 février 2020, l'OMS a enregistré 82 294 cas de COVID-19 dans 46 pays. Parmi ceux-ci, 78 630 ont été signalés en Chine et ont entraîné 2 747 décès.

Le 30 janvier 2020, l'OMS a déclaré que l'épidémie de COVID-19 était une urgence de santé publique de portée internationale. Cette désignation fait du diagnostic de laboratoire fiable un élément essentiel des efforts d'intervention en matière de santé publique. "Notre objectif est de détecter rapidement les nouveaux cas et de prévenir la propagation du coronavirus", a déclaré le directeur des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) américains, Robert R. Redfield, MD.

La propagation mondiale du virus menaçant de provoquer une pandémie de COVID-19, une détection précoce peut favoriser le développement de vaccins et de médicaments. Nous examinons ici comment les tests de diagnostic de la COVID-19 ont évolué rapidement, des premiers cas aux dernières infections.

Au début de cette année, les chercheurs ont recueilli des échantillons de liquide bronchoalvéolaire sur les premiers patients et les ont testés pour 22 virus et bactéries en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (PCR). Les souches de coronavirus identifiées précédemment et d'autres agents pathogènes connus pour provoquer des symptômes respiratoires n'ont pas été détectés dans les échantillons. C'était la première indication que l'agent infectieux était un nouveau pathogène, non identifié auparavant.

L'équipe a ensuite isolé des particules de virus sur les mêmes patients et les a examinées au microscope électronique à transmission. Le virus a montré des pics distinctifs caractéristiques des coronavirus. Ils ont utilisé la transcriptase inverse PCR (RT-PCR) pour amplifier une région conservée des bêtacoronavirus, ce qui a donné des résultats positifs. Les bêtacoronavirus ont déjà été impliqués dans des épidémies de syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS) et de syndrome respiratoire du Moyen-Orient (SRE).

Enfin, les chercheurs ont séquencé le génome viral. Ils ont procédé à l'alignement des séquences et à l'analyse phylogénétique du nouveau génome du virus en utilisant d'autres génomes de bêtacoronavirus (SRAS-CoV et MERS-CoV) comme référence. Il y avait moins de 90 % de similarité entre les domaines conservés du virus inconnu et ceux des autres membres de la famille des bêtacoronavirus. Les chercheurs ont donc conclu que les symptômes respiratoires des patients étaient causés par un nouveau bêtacoronavirus

Au cours des semaines qui ont suivi les premiers cas signalés, les chercheurs en maladies infectieuses ont déposé les séquences du génome du SRAS-CoV-2 dans des bases de données ouvertes telles que GenBank et GISAID. Cela a incité la communauté internationale des scientifiques et des professionnels de la médecine à mettre au point des diagnostics moléculaires rapides et fiables.

Des chercheurs de l'Institut de virologie de Berlin ont mis au point des tests permettant de distinguer l'infection par le CoV-2 du CoV-SAR en se basant sur la séquence nucléotidique du gène de l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp). Ils ont validé la réactivité croisée des tests en utilisant 297 échantillons cliniques obtenus de patients infectés par des agents pathogènes respiratoires connus. Un groupe distinct de l'Université de Hong Kong a mis au point un test RT-PCR quantitatif en une étape pour détecter deux régions différentes du cadre de lecture ouvert du génome 1b (ORF1b) du SRAS-CoV-2 et la région de la nucléocapside (N). Ils ont validé le test chez deux patients suspectés de COVID-19. Le test du gène N était environ 10 fois plus sensible que le test ORF1b dans ces échantillons cliniques. Les tests conçus par les deux groupes ont été partagés avec l'OMS et expédiés pour être utilisés dans plusieurs pays.

Aux États-Unis, le CDC a développé un test RT-PCR qualitatif en temps réel pour détecter les coronavirus de type SRAS et pour identifier spécifiquement le SARS-CoV-2. Les amorces et les sondes ont été conçues contre la région de la nucléocapside du virus. Auparavant, les échantillons obtenus auprès d'individus suspectés d'être porteurs du COVID-19 devaient être envoyés au CDC pour être testés. Cependant, le 4 février 2020, la Food and Drug Administration (FDA) a délivré une autorisation d'utilisation d'urgence du panel de diagnostic RT-PCR du CDC. Désormais, le test peut être envoyé aux laboratoires de santé publique locaux et d'État des États-Unis, aux laboratoires du ministère de la défense et à certains laboratoires internationaux. "La situation continue d'évoluer et la possibilité de distribuer ce test de diagnostic à des laboratoires qualifiés est une étape cruciale pour la protection de la santé publique", a déclaré le commissaire de la FDA, Stephen M. Hahn, MD

Bien que la RT-PCR soit un test très sensible, elle peut présenter certains inconvénients. Les amorces de RT-PCR sont généralement conçues contre des régions conservées du génome viral du SRAS-CoV-2. Les coronavirus ont des ARN-polymérases ARN-dépendantes sujettes aux erreurs, ce qui rend les mutations et les recombinaisons fréquentes. Les mutations dans le CoV-2 du SRAS sont actuellement très limitées. Il convient d'examiner comment la spécificité et la sensibilité diagnostiques des tests basés sur la RT-PCR peuvent être affectées si le taux de mutation change

De faibles charges virales chez des patients asymptomatiques ou légèrement symptomatiques peuvent ne pas être détectées de manière fiable par RT-PCR. Bien que des résultats positifs indiquent une infection active par le CoV-2 du SRAS, ils n'excluent pas une infection bactérienne ou une co-infection avec d'autres virus. Les résultats positifs et négatifs doivent être interprétés en combinaison avec les symptômes cliniques et les données épidémiologiques

Certains laboratoires de santé publique des États ont rencontré des problèmes lors de la validation du test RT-PCR du CDC américain. Ils ont rapporté des résultats positifs pour les contrôles négatifs de l'essai. Cela produit un résultat peu concluant qui empêche un diagnostic clinique fiable. "...un des réactifs n'était pas performant de manière constante...refaire la fabrication est la prochaine étape", a déclaré Nancy Messonnier, MD, directrice du Centre national d'immunisation et des maladies respiratoires du CDC, lors d'une téléconférence

Actuellement, les tests de diagnostic sont effectués sur les liquides respiratoires (aspirateurs nasopharyngés, lavage bronchoalvéolaire et crachats) et le sérum. Cependant, une étude qui a utilisé des amorces pour amplifier le gène du pic (S) du SRAS-CoV-2 n'a pas pu détecter de manière fiable le virus dans les fluides corporels non respiratoires tels que le sang et l'urine. Le CDC travaille à la mise au point d'un test sanguin qui permettra de détecter les anticorps produits contre le CoV-2 du SRAS. Cela permettra de mieux comprendre la transmission de la maladie et de détecter l'infection chez les personnes ne présentant que peu ou pas de symptômes.

La FDA américaine a créé un modèle d'examen d'autorisation d'utilisation d'urgence qui est disponible sur demande pour les développeurs de tests de diagnostic. À ce jour, ce modèle a été partagé avec plus de 50 développeurs qui ont exprimé leur intérêt pour le développement de diagnostics pour COVID-19