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Les guides optimisés du système CRISPR peuvent cibler l'ARN, y compris l'ARN des coronavirus

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Une fois éclipsés par les systèmes CRISPR ciblant l'ADN, les systèmes CRISPR ciblant l'ARN entrent dans la lumière.

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De plus, les systèmes CRISPR ciblant l'ARN progressent vers des applications importantes pour lesquelles ils sont particulièrement bien adaptés. Par exemple, ils peuvent faire taire l'expression des gènes au niveau transcriptionnel, ce qui est avantageux si les cibles correspondantes au niveau génomique sont difficiles d'accès. De plus, les systèmes CRISPR de ciblage de l'ARN peuvent être efficaces pour cibler les virus à ARN tels que les coronavirus ou les virus de la grippe.

Pour améliorer le ciblage d'un système CRISPR, des scientifiques du New York Genome Center et de l'Université de New York (NYU) ont élaboré les règles de conception de l'ARN guide du système. Ce système repose sur une enzyme appelée Cas13, qui se complexifie avec l'ARN guide, qui se lie à l'ARN messager complémentaire. Plus la correspondance entre l'ARN guide et l'ARN messager est bonne, plus l'action de réduction au silence du gène Cas13 est efficace.

Les scientifiques, dirigés par Neville Sanjana, PhD, professeur assistant au département de neuroscience et de physiologie de l'Université de New York, ont mis au point une plateforme permettant de réaliser des criblages génétiques massivement parallèles au niveau de l'ARN dans les cellules humaines. Selon les scientifiques, la technologie de criblage peut être utilisée pour comprendre de nombreux aspects de la régulation de l'ARN et pour identifier la fonction des ARN non codants, qui sont des molécules d'ARN produites mais qui ne codent pas pour les protéines.

Les détails des travaux des scientifiques ont été publiés le 16 mars dans Nature Biotechnology, dans un article intitulé "Des écrans Cas13 massivement parallèles révèlent les principes de conception de l'ARN guide" L'article décrit comment les scientifiques ont utilisé les écrans pour cibler les ARN messagers d'un transgène de protéine fluorescente verte et des protéines de surface CD46, CD55 et CD71 dans les cellules humaines. Au total, les scientifiques ont mesuré l'activité de 24 460 ARN guides avec et sans décalage par rapport aux séquences cibles.

"L'efficacité de la lutte contre la maladie est déterminée par les caractéristiques spécifiques de l'ARNg et le contexte du site cible", écrivent les auteurs de l'article. "Les mésappariements simples réduisent généralement le knockdown à un degré modeste, mais les nucléotides espaceurs 15-21 sont largement intolérants aux mésappariements des sites cibles"

En ciblant des milliers de sites différents dans les transcriptions d'ARN humain, les chercheurs ont développé un modèle prédictif basé sur l'apprentissage machine pour accélérer l'identification des ARN guides Cas13 les plus efficaces. La nouvelle technologie est mise à la disposition des chercheurs par le biais d'un site web interactif et d'une boîte à outils open-source pour prédire l'efficacité des ARN guides pour des cibles ARN personnalisées et fournit des ARN guides préconçus pour tous les gènes codant pour les protéines humaines.

"Nous prévoyons que les enzymes Cas13 ciblant l'ARN auront un grand impact sur la biologie moléculaire et les applications médicales, mais on sait peu de choses sur la conception de l'ARN guide pour une efficacité de ciblage élevée", a déclaré Sanjana, auteur principal de l'étude actuelle. "Nous avons entrepris de changer cela grâce à une étude approfondie et systématique visant à développer des principes clés et une modélisation prédictive pour la conception de guides les plus efficaces"

Les enzymes Cas13 sont des enzymes de type VI CRISPR (regroupements de courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées) qui ont récemment été identifiées comme des protéines programmables guidées par l'ARN, ciblant l'ARN et ayant une activité de nucléase qui permet de détruire le gène cible sans altérer le génome. Cette propriété fait de Cas13 une thérapie potentiellement importante pour influencer l'expression des gènes sans altérer de façon permanente la séquence du génome.

Le chercheur postdoctoral Hans-Hermann Wessels et le doctorant Alejandro Méndez-Mancilla, qui sont les co-premiers auteurs de l'étude, ont développé une série de nouveaux outils basés sur Cas13 et ont réalisé un écran de tuilage et de permutation des transcriptions dans les cellules de mammifères.

"Nous avons superposé les ARN guides à de nombreux transcrits différents, y compris plusieurs gènes humains pour lesquels nous pouvions facilement mesurer la chute des transcrits par coloration des anticorps et cytométrie de flux", a déclaré M. Wessels. "En cours de route, nous avons découvert des connaissances biologiques intéressantes qui pourraient étendre l'application des enzymes Cas13 ciblant l'ARN"

Parmi les conclusions de l'équipe, par exemple, figurent des indications sur les régions de l'ARN guide qui sont les plus importantes pour la reconnaissance d'un ARN cible. En utilisant des milliers d'ARN guides avec une, deux ou trois erreurs d'une seule lettre par rapport à leur ARN cible, ils ont identifié une région "semence" critique qui est particulièrement sensible aux erreurs d'appariement entre le guide CRISPR et la cible.

Cette découverte aidera les scientifiques à concevoir des ARN guides pour éviter une activité hors cible sur des ARN cibles non intentionnels. Étant donné qu'une cellule humaine typique exprime environ 100 000 ARN, le ciblage précis de Cas13 sur la seule cible prévue est vital pour le dépistage et les applications thérapeutiques.

En plus d'approfondir notre compréhension des espèces hors cible de Cas13, la région "semences" pourrait être utilisée pour les biocapteurs de la prochaine génération qui peuvent distinguer plus précisément les espèces d'ARN étroitement apparentées. Au total, cette étude augmente de plus de deux ordres de grandeur le nombre de points de données des précédentes études Cas13 dans les cellules de mammifères.

"Nous sommes particulièrement enthousiastes à l'idée d'utiliser le système de dépistage Cas13 optimisé pour cibler les ARN non codants", a déclaré Mme Méndez-Mancilla. "Cela élargit considérablement la boîte à outils du CRISPR pour les dépistages génétiques et transcriptomiques avancés"

Dans l'étude, les chercheurs ont remarqué une différence marquée dans le knockdown des protéines lorsqu'elles ciblent différents éléments codant et non codant des ARN messagers, et ils ont trouvé des preuves que Cas13 est en concurrence avec d'autres protéines de liaison à l'ARN impliquées dans le traitement et l'épissage des transcriptions.

L'équipe a récemment utilisé son modèle prédictif d'ARN guide pour une analyse particulièrement critique : L'urgence de santé publique COVID-19 est due à un coronavirus, qui contient un ARN et non un génome d'ADN. En utilisant le modèle dérivé de leurs écrans massivement parallèles, les chercheurs ont identifié des ARN guides optimaux qui pourraient être utilisés pour de futures applications de détection et thérapeutiques. Les prévisions concernant les ARN guides de Cas13 pour une souche de SRAS-CoV-2 isolée à New York ont été mises en ligne (http://bit.ly/coronavirus-guides).