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La pandémie de COVID-19 est un défi mondial permanent pour les systèmes de santé publique. L'identification précoce et ultrasensible de l'infection est essentielle pour prévenir l'infection généralisée par COVID-19 chez les personnes présymptomatiques et asymptomatiques, en particulier dans la communauté et à domicile. Nous faisons la démonstration d'une plateforme électrochimique multiplexée, portable et sans fil pour la détection ultra-rapide de la COVID-19 : le SARS-CoV-2 RapidPlex.
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Il détecte la protéine nucléocapside de l'antigène viral, les anticorps IgM et IgG, ainsi que la protéine C-réactive, biomarqueur inflammatoire, grâce à nos électrodes en graphène gravées au laser et produites en masse. Nous faisons la démonstration d'une détection électrochimique ultrasensible, hautement sélective et rapide dans les plages physiologiquement pertinentes. Nous avons évalué avec succès l'applicabilité de notre plateforme RapidPlex SARS-CoV-2 avec des échantillons de sang et de salive COVID-19-positifs et COVID-19-négatifs. Sur la base de cette étude pilote, notre plateforme d'immunocapteurs multiplexés pourrait permettre de réaliser des tests à haute fréquence à domicile pour le diagnostic et la surveillance de la télémédecine COVID-19.
Introduction
Le 11 mars 2020, l'Organisation mondiale de la santé a qualifié l'épidémie de COVID-19 de pandémie. Six mois plus tard, la crise sanitaire mondiale s'était poursuivie avec plus de 30 millions de cas confirmés de nouveaux coronavirus dans le monde, dont plus de 22 % aux États-Unis1. On estime que 14 % à 20 % des patients développeront une maladie grave nécessitant une hospitalisation2. Les premiers efforts pour atténuer la propagation par le biais d'ordonnances de "séjour à domicile" imposées par les États ont semblé efficaces ; toutefois, la réouverture de l'économie américaine a entraîné une nouvelle propagation exponentielle des nouveaux coronavirus, comme prévu3 On estime que le produit intérieur brut des États-Unis subira des pertes de plus de 45,3 milliards de dollars au cours d'une pandémie de type grippal sans vaccins disponibles.4 La réouverture sûre de l'économie, des écoles et des universités nécessite de multiples approches pour atténuer les risques associés à COVID-19, notamment des mesures simples, abordables et efficaces de test et de traçage.
Il est difficile de contenir la propagation en raison des difficultés à identifier les individus infectieux. La plupart des cas de propagation communautaire de COVID-19 peuvent se produire en l'absence de symptômes. Le pic de virémie peut se situer à la fin de la période d'incubation, ce qui permet une charge virale suffisante pour la transmission 1 à 2 jours avant l'apparition des symptômes.3 En outre, en raison de la durée et de la prévalence inconnues des cas asymptomatiques, le véritable taux de reproduction peut être sous-estimé.5 , 6 L'incidence déclarée des patients asymptomatiques varie de 17,9 % à 30,8 %.7 , 8
L'accès accru au test COVID-19 a permis de mieux surveiller la propagation de la communauté, mais plusieurs problèmes de diagnostic demeurent. Actuellement, la méthode de test standard est la PCR en temps réel de l'acide nucléique viral (RT-PCR), qui est un processus lent9 et nécessite un équipement coûteux et des techniciens formés pour la collecte et l'analyse des échantillons par écouvillonnage nasopharyngé9. En outre, le volume même des tests requis dépasse la capacité des systèmes de santé à communiquer les résultats de la RT-PCR aux patients, ce qui entraîne, dans certains États, des retards de ∼7-10 jours pour informer des résultats positifs10 et pour mettre en place des protocoles d'isolement et de surveillance. Malgré les récents progrès réalisés dans le domaine des tests RT-PCR rapides au point de service (POC)11, 12, 13, 14, 15, les tests d'acide nucléique sont également connus pour produire des faux négatifs, ce qui peut limiter les stratégies de confinement et l'accès au traitement16. L'identification des personnes convalescentes sur la base de la présentation des anticorps COVID-19 est tout aussi importante, car elle peut fournir aux autorités sanitaires des informations cruciales concernant l'impact potentiel des mesures de réouverture.17 Les tests sérologiques détectent les anticorps circulants spécifiques aux antigènes COV-2 du SRAS, y compris la protéine de la nucléocapside et la protéine du pic externe.9, 18 Toutefois, il n'est pas possible de différencier les porteurs asymptomatiques des personnes immunisées en utilisant la détection des anticorps. Par conséquent, pour atténuer efficacement les risques de propagation de la communauté COVID-19, il est nécessaire de disposer de systèmes qui déterminent simultanément le statut viral et sérologique d'un individu. En outre, des études récentes montrent une corrélation entre la concentration des biomarqueurs inflammatoires circulants et la gravité de la COVID-19.19 Une concentration accrue de protéine C-réactive (PCR) est observée chez les patients chez qui une pneumonie COVID-19 a été diagnostiquée et est associée à une gravité croissante, ce qui suggère un rôle dans le diagnostic et le pronostic des patients atteints de COVID-19.20 , 21
Il existe un besoin clair et urgent d'un test COVID-19 de télémédecine très sensible, rapide et peu coûteux, capable d'identifier le statut d'infection passé et présent d'un patient.22 Des progrès ont été réalisés dans le domaine du test COVID-19 au PS, mais tous les kits de test disponibles dans le commerce ne fournissent que des résultats qualitatifs. L'analyse quantitative des biomarqueurs COVID-19 à l'aide d'un dispositif de télémédecine peut fournir des informations prédictives de la gravité de la maladie et fournir des informations de séroconversion concernant l'évolution de la maladie dans le temps. Les biocapteurs électrochimiques, à cet égard, sont avantageux en raison de leur efficacité de détection rapide et de leur facilité d'utilisation pour les applications au PS.23, 24, 25, 26, 27 Le prélèvement simple, sûr et efficace d'échantillons de COVID-19 s'est avéré difficile compte tenu des exigences actuelles en matière de tests. Les tests au PS compatibles avec la salive seraient avantageux, car la salive contient de nombreuses informations et peut être facilement et de manière non invasive prélevée par les patients eux-mêmes pour les tests de télémédecine.28
Nous présentons ici une nouvelle plateforme électrochimique multiplexée, portable et sans fil pour la détection ultra-rapide de COVID-19 : SARS-CoV-2 RapidPlex (figure 1). Cette plateforme détecte quantitativement des biomarqueurs spécifiques à COVID-19 dans le sang et la salive, notamment la protéine de nucléocapside (NP) du SRAS-CoV-2, des immunoglobulines (Igs) spécifiques contre la protéine de pic (S1) du SRAS-CoV-2 (S1-IgM et S1-IgG) et la CRP, dans des plages physiologiquement pertinentes. La plateforme utilise des antigènes et des anticorps de capture immobilisés sur des électrodes en graphène gravé au laser (LEG)29 , 30, produites en masse et à faible coût. Cette plateforme multiplexée suit la progression de l'infection en diagnostiquant le stade de la maladie, ce qui permet d'identifier clairement les individus qui sont infectieux, vulnérables et/ou immunisés (tableau 1). Les principales caractéristiques du SARS-CoV-2 RapidPlex sont la haute sensibilité, le faible coût, la détection ultra-rapide, la télécommande sans fil et la détection multiplexée qui fournit des informations sur trois aspects clés de la maladie COVID-19 : l'infection virale (NP)31 , la réponse immunitaire (IgG et IgM)9 et la gravité de la maladie (CRP)19, 20, 21
Résultats et discussion
Conception de la plate-forme RapidPlex SARS-CoV-2
Comme l'illustre la figure 1A, le SARS-CoV-2 RapidPlex est composé de quatre électrodes de travail en graphène (WE), d'une électrode de référence Ag/AgCl (RE) et d'une contre-électrode en graphène (CE), toutes modelées sur un substrat en polyimide (PI) par gravure au laser CO2, une méthode de production rapide, à haut débit et rentable (figures 1B et 1C). Notre groupe a récemment démontré l'utilisation d'une structure de graphène mésoporeux fabriquée par gravure laser pour une biodétection à haute performance et à faible coût.29, 30 Le coût des matériaux pour la plate-forme RapidPlex non modifiée est de l'ordre de 0,05 $ ; les coûts supplémentaires des produits chimiques et des réactifs pour la préparation des capteurs multiplexés sont de l'ordre de quelques dollars selon la taille des commandes. La détection de protéines cibles sélectionnées (NP et CRP) et d'immunoglobulines spécifiques (S1-IgG et S1-IgM) est réalisée par des stratégies d'immunodétection en sandwich et indirecte sur les électrodes LEG, respectivement. Les propriétés supérieures du graphène, en termes de grande mobilité de charge et de surface, ainsi que la grande sensibilité et la sélectivité des stratégies de détection impliquant à la fois des récepteurs de capture et de détection, font de notre dispositif (figure 1D) un outil très pratique pour la détection rapide, précise et spécifique de l'infection par COVID-19 dans le sang ainsi que dans les échantillons de biofluides non invasifs, tels que la salive.
Caractérisation électrochimique de la plate-forme RapidPlex SARS-CoV-2
Les étapes de fonctionnalisation et de modification effectuées sur les surfaces des LEG pour la fixation covalente de chacun des récepteurs spécifiques nécessaires au développement de notre plateforme SARS-CoV-2 RapidPlex sont schématisées sur la figure 2 A. L'acide pyrènebutyrique (PBA) est utilisé comme lieur pour ancrer les récepteurs requis à la couche de graphène. Bien que la fixation de groupes fonctionnels directement sur la surface de l'atome de carbone sp2 soit l'une des méthodes courantes pour fonctionnaliser le graphène, ces méthodes sont associées à l'exigence de défauts ou d'arêtes dans le matériau du capteur, qui pourraient modifier ses propriétés physiques spécifiques32 33 En revanche, l'introduction de groupes fonctionnels sur la couche de détection au moyen de dérivés du pyrène est préférable ici, car elle ne perturbe pas la conjugaison des feuilles de graphène et améliore sa stabilité.34 35 Le PBA, composé d'un groupe pyrène qui contient des électrons π et d'un groupe carboxylique, est utilisé pour fonctionnaliser les couches de graphène par empilage π et interactions hydrophobes. Les unités pyrène du PBA interagissent fortement avec les couches de graphène de telle sorte que la structure et les propriétés originales du graphène sont bien conservées. Les fragments fonctionnels contenus dans chaque molécule de PBA permettent la préparation de la plate-forme de biodétection basée sur l'affinité grâce au couplage covalent entre les groupes carboxyliques des unités de PBA et les groupes -NH2 des récepteurs de capture respectifs (anticorps spécifiques ou protéines de capture). Le blocage des sites n'ayant pas réagi avec la sérum-albumine bovine (SBA) empêche l'adsorption non spécifique des autres molécules impliquées dans chaque configuration de test ou circulant dans l'échantillon d'intérêt.
Les techniques de voltampérométrie différentielle à impulsions (DPV) et de spectroscopie d'impédance électrochimique à potentiel en circuit ouvert (OCP-EIS) sont utilisées pour caractériser et prouver électrochimiquement les processus auto-assemblés par étapes dans les deux configurations d'essai pour la détection de molécules cibles sélectionnées. Les lectures DPV reflètent une intensité de courant de pointe inférieure après chaque étape de modification liée au test S1-Ig en raison de la diffusion entravée du marqueur redox à la surface de l'électrode dérivée à la fois des groupes carboxyles et des protéines et macromolécules biologiques attachées (figure 2B). En même temps, la résistance dans les tracés de Nyquist de l'OCP-EIS est augmentée après chaque étape de fonctionnalisation (figure 2C). La réussite de l'ancrage de l'ABP a également été vérifiée au moyen de la microscopie électronique à balayage (MEB) (figure S1). La caractérisation électrochimique de la modification du capteur basée sur le test sandwich en utilisant la PCR comme molécule modèle et les techniques susmentionnées sont présentées sur la figure S2.
Pour préserver la structure et les propriétés natives des biomolécules liées, nous avons choisi le PBA comme lieur hétérobifonctionnel, empêchant efficacement l'interaction directe entre les grandes biomolécules et la surface de graphène.33 Pour vérifier cette sélection, nous avons construit des configurations de dosage des IgG spécifiques à la CRP et au SARS-CoV-2 sur des électrodes de graphène fonctionnalisées avec du PBA et un autre lieur commun, l'acide 1H-pyrrole-1-propionique (PPA).30 Des rapports signal/blanc (S/B) plus élevés ont été observés pour les deux tests où le PBA était utilisé comme support de liaison (figure 2D), principalement en raison d'une diminution significative des signaux obtenus en l'absence de la molécule cible correspondante lorsque le PBA était utilisé à la place du PPA. Associé à une stratégie de blocage optimale, le PBA peut être utilisé pour l'immobilisation de sondes biomoléculaires spécifiques (par exemple, anticorps, protéines) tout en évitant les adsorptions non spécifiques dans le contexte des immunoessais36
L'orientation des protéines antigéniques modifiées sur les surfaces solides est fortement associée à leur activité et à leur réactivité. Des anticorps spécifiques anti-His peuvent être utilisés pour orienter l'immobilisation des récepteurs antigéniques contenant des résidus d'histidine, mais cela implique une étape supplémentaire par rapport à leur fixation directe sur la couche de détection, comme le montre la figure S3A. Nos résultats ne montrent aucune différence significative dans la performance du test pour la détection des IgG sur des électrodes de PBA-graphène fonctionnalisées de manière covalente avec la protéine d'enrobage spécifique (immobilisation directe) et avec des anticorps anti-His pour la capture précédente de la protéine d'enrobage spécifique de la marque polyhistidine (immobilisation orientée) (Figure S3B), ce qui prouve que l'orientation aléatoire de la protéine n'interfère pas avec l'accessibilité de l'épitope pour une reconnaissance efficace par des anticorps cibles spécifiques. Ceci est en accord avec d'autres rapports confirmant que les antigènes de fusion His-tagged peuvent être directement immobilisés sur différentes surfaces avec des orientations protéiques totalement compatibles avec la reconnaissance des anticorps.37, 38, 39, 40 Pour simplifier et réduire le coût et la durée du test, nous avons procédé à l'immobilisation directe de la protéine S1 pour la détection d'Ig spécifiques.
Considérant que la liaison rapide des cibles est essentielle à la réussite de la mise en œuvre de notre plateforme proposée en tant que système POC, nous avons étudié comment la durée d'incubation des cibles (ou des échantillons) affecte la réponse de chaque biocapteur composant notre plateforme RapidPlex SARS-CoV-2. La figure 2E résume les signaux ampérométriques obtenus pour chacune des quatre unités de détection à différents temps d'incubation (1, 5 et 10 min) en l'absence (blanc, B) et en présence (S) de 500 pg mL-1, 250 ng mL-1 et 50 ng mL-1 de NP, d'isotypes IgG et IgM spécifiques au SRAS-CoV-2 et de CRP, respectivement. Il est important de noter que bien qu'un temps d'incubation de 10 minutes ait été choisi pour la plupart des études ici afin d'assurer la plus grande sensibilité pour la détermination des niveaux ultra-faibles de chaque molécule cible, une différence significative entre l'absence et la présence de chacune des cibles correspondantes est obtenue avec un temps d'incubation de seulement 1 minute. Cela constitue l'un des principaux avantages de notre système SARS-CoV-2 RapidPlex en tant que dispositif POC rapide pour la surveillance de l'infection par le SARS-CoV-2 avec la sensibilité requise pour la détermination des protéines et des Ig. On a très récemment fait appel à la technique ELISA17 , 41, 42, 43, 44, à l'amplification des acides nucléiques45, 46, 47, 48, 49, à la spectrométrie de masse50 , voire à des combinaisons51 pour déterminer les molécules cibles spécifiques du CoV-2-SARS proposées, entre autres. Toutefois, la plupart de ces méthodes présentent des écueils cruciaux, principalement en termes de préparation des échantillons, de complexité et d'exigences en matière d'équipement coûteux et encombrant, ce qui les rend encore très difficiles à mettre en œuvre en tant que systèmes au point de vente. Notre appareil offre une alternative intéressante aux tests standard pour la détermination des protéines, comme l'ELISA, en raison de ses capacités de multiplexage, de sa fonctionnalité à distance et de son court délai de réponse.
Évaluation des performances analytiques du RapidPlex SRAS-CoV-2
La performance de chaque biocapteur contenu dans le RapidPlex SARS-CoV-2 a été caractérisée dans des solutions salines tamponnées au phosphate (PBS) complétées par 1,0% de BSA en mesurant l'ampérométrie en présence de concentrations accrues de NP, S1-IgG, S1-IgM et CRP (Figure 3 ). Les stratégies sélectionnées pour l'antigène viral NP et les protéines CRP sont basées sur des configurations double-sandwich et sandwich, respectivement, comme l'illustre la figure 3A. Les immunoessais en sandwich pour la détection d'antigènes sont, en général, très sensibles en raison de l'implication de deux anticorps différents comme entités de capture et de détection. Compte tenu des faibles niveaux qui doivent être atteints pour le NP et le CRP dans le sérum et la salive dilués (pg mL-1 à ng mL-1), nous pensons que ces stratégies sont les plus adaptées pour être mises en œuvre sur notre plateforme. La variation des courants cathodiques en fonction de la concentration de NP et de CRP dans les solutions tamponnées est présentée dans les figures 3B et 3C, respectivement. Les S1-IgG et S1-IgM ont été détectés sur la base d'immunoessais indirects (figure 3D), qui sont considérés comme très adaptés à la détection de macromolécules circulantes dans les antisérums et autres biofluides. Les figures 3E et 3F montrent les courbes d'étalonnage pour la détermination des Ig spécifiques de S1 (S1-IgG et S1-IgM, respectivement) dans des solutions tamponnées. La reproductibilité a été démontrée par les valeurs de l'écart type relatif (RSD) obtenues avec différents biocapteurs préparés de la même manière à des jours différents. Les valeurs RSD de 6,3%, 8,4%, 6,0% et 7,6% pour 20 ng mL-1 de CRP, 250 ng mL-1 de S1-IgG, 250 ng mL-1 de S1-IgM et 500 pg mL-1 d'antigène NP (n = 5) démontrent une bonne reproductibilité tant dans la préparation du dispositif que dans la transduction du signal. En outre, les capteurs ont montré des réponses stables sur une période de stockage de 5 jours à 4°C (figure S4). Nous n'avons pas observé de variations significatives de la pente entre les données obtenues dans du sérum humain correctement dilué et dans des solutions tamponnées pour la détermination de chaque analyte cible (par exemple, la valeur de sensibilité de la pente [16,28 nA mL ng-1] obtenue pour la CRP comme analyte modèle dans des solutions tamponnées de PBS est presque la même que celle des échantillons de sérum dilués provenant d'un volontaire sain [16.64 nA mL ng-1]) ; par conséquent, une quantification précise des analytes cibles proposés peut être réalisée en effectuant une simple interpolation des lectures cathodiques obtenues pour chaque échantillon testé dans la courbe d'étalonnage correspondante construite en solution tamponnée.
Étant donné que la sensibilité et la spécificité diagnostiques des études de séroprévalence peuvent être améliorées en utilisant un mélange de protéines antigéniques au lieu d'une seule protéine52, 53 , nous avons modifié le graphène avec un mélange d'antigènes liés au SRAS-CoV-2, NP et S1, pour capturer des isotypes d'immunoglobulines spécifiques contre les deux antigènes dans le même WE. Une courbe d'étalonnage pour la détection de (NP + S1)-IgG est présentée à la figure S5. Ainsi, cette méthodologie peut être adaptée pour détecter les IgG (ou IgM) spécifiques d'un isotype ou une combinaison des deux isotypes d'Ig dans la même surface de détection afin de mieux capturer la concentration totale d'Ig et d'augmenter ainsi la sensibilité du test dans la population de patients.
Enquête sur la sélectivité et la performance multiplexée du RapidPlex SARS-CoV-2
Les biofluides humains contiennent un mélange complexe et variable de molécules circulantes qui pourraient interférer avec la détection moléculaire. En outre, une diaphonie négligeable entre les différentes surfaces de travail est une condition essentielle pour effectuer des lectures de détection multiplexées de manière précise et significative. C'est pourquoi la sélectivité et la diaphonie de la plateforme RapidPlex SARS-CoV-2 ont été évaluées. Les lectures ampérométriques obtenues pour chaque biocapteur développé contre des molécules non ciblées sont présentées à la figure 4 A. Nous avons évalué la liaison spécifique des biomarqueurs du CoV-2-SARS par rapport aux biomarqueurs de coronavirus similaires, notamment le CoV-SARS et le CoV-MERS. Nous n'avons observé aucune réaction croisée significative pour les tests NP, S1-IgG, S1-IgM et CRP en présence de chaque interférent testé, y compris SARS-CoV-2 S1, SARS-CoV S1 et CRP (pour le test NP), SARS-CoV-2 NP-IgG, SARS-CoV IgG, MERS-CoV IgG, S1-IgG, et des contrôles négatifs contenant des mélanges d'IgG et d'IgM contre le MERS-CoV et le SARS-CoV (pour les tests S1-IgG et S1-IgM), et le peptide natriurétique de type B (BNP), le NP, le SARS-CoV NP et le SARS-CoV S1 (pour le test CRP), respectivement. Cependant, l'interférence de l'antigène viral NP-CoV-SARS a fourni un courant cathodique correspondant à ∼80% du courant brut obtenu pour la détection de l'antigène NP spécifique. Les protéines du pic, de l'enveloppe et de la membrane du CoV-SARS-2 partagent une identité de séquence de 76 à 95 % avec celles du CoV-SARS. Ce pourcentage d'homologie est réduit à 30-40% pour le CoV-MERS. De même, comme le NP-CoV-2 du SRAS est identique à 90 % au NP-CoV du SRAS17 , 54, 55, 56, on s'attendait à ce que l'antigène du NP-CoV du SRAS interfère avec celui-ci. Toutefois, le manque de sélectivité dans ce cas particulier n'est pas une préoccupation majeure en raison de l'absence de nouveaux cas de CoV-SARS détectés récemment ; on peut donc en déduire que cette interférence ne constituera pas une barrière pour la détermination sélective du NP-CoV-2 du SRAS dans des échantillons réels. Nous avons ensuite évalué les concentrations dérivées de l'ampérométrie avec les concentrations dérivées de l'absorbance recueillies par ELISA. Comme le montre la figure 4B, les résultats de notre biocapteur électrochimique fonctionnalisé ont été corrélés linéairement (r = 0,955) avec les résultats obtenus avec les mêmes réactifs dans un protocole ELISA traditionnel.
Une fois que les performances et la sélectivité de chaque biocapteur construit ont été évaluées individuellement et de manière exhaustive, nous démontrons les capacités de multiplexage de notre dispositif à réseau de graphène à quatre électrodes de travail (4WE) conçu avec un Ag/AgCl RE et un graphène CE. Les figures 4C et 4D illustrent le schéma fonctionnel des unités fonctionnelles qui constituent le système électronique intégré. Les lectures ampérométriques des quatre canaux sont prises simultanément et les données sont transmises sans fil à un dispositif utilisateur via Bluetooth. Le système électronique, qui comprend la carte de circuit imprimé (PCB) et une batterie au lithium-ion polymère, mesure 20 × 35 × 7,3 mm. L'appareil compact peut effectuer des mesures ampérométriques en continu pendant plus de 5 h sur une seule charge.
Dans le but de démontrer l'utilité de notre réseau RapidPlex SARS-CoV-2 pour la quantification multiplexée et simultanée de molécules cibles sélectionnées, nous avons évalué la réaction croisée potentielle résultant de la diffusion de substances signal entre des immunosurfaces adjacentes. À cette fin, chacune des quatre surfaces de travail fonctionnalisées de manière pratique a été incubée avec des solutions tamponnées contenant une concentration significativement élevée de chacune des cibles sélectionnées, suivie des récepteurs de détection correspondants dans chaque cas. L'absence de diaphonie entre les EW adjacents est vérifiée à partir des relevés expérimentaux dans des solutions tamponnées contenant 1,0 ng mL-1 d'antigène NP (I), 250 ng mL-1 d'IgG (II) et d'IgM (III) spécifiques de S1, et 50 ng mL-1 de CRP (IV) (figure 4E). Comme prévu, un signal nettement plus élevé a été obtenu lorsque chaque cible a été spécifiquement capturée et marquée par son anticorps traceur dans l'immunosurface fonctionnalisée correspondante. Ces résultats, associés à ceux de la figure 4A, démontrent la faisabilité de la plateforme RapidPlex SARS-CoV-2 développée pour la détermination rapide, sélective et fiable des isotypes NP, S1-IgG et S1-IgM, et de la CRP en une seule expérience. Il convient de noter que, puisque les IgG et les IgM ont des mécanismes de liaison similaires à ceux des antigènes viraux et que la quantification individuelle des immunoglobulines ne nécessite pas de mélange des étiquettes spécifiques des détecteurs, des gouttelettes individuelles ont été utilisées sur les électrodes de détection des IgG et des IgM pendant la modification et l'étiquetage.
Détection des cibles sélectionnées liées au CoV-2 dans les échantillons biologiques humains
Pour prouver l'utilité de notre appareil dans un scénario plus complexe et plus réel, nous avons évalué les capacités multiplexées du RapidPlex SARS-CoV-2 dans des échantillons de sérum représentatifs de sujets COVID-19 RT-PCR négatifs et positifs. Les données des capteurs des échantillons de sérum d'un sujet négatif à la RT-PCR (figure 5 A) et d'un patient positif à la RT-PCR (figure 5B) montrent une diaphonie minimale dans une matrice d'échantillons réelle et complexe, ce qui indique la fonctionnalité efficace du SARS-CoV-2 RapidPlex pour différencier simultanément la présence surexprimée des rapporteurs cibles liés au SARS-CoV-2 dans les échantillons COVID-19-positifs. En outre, le dispositif SARS-CoV-2 RapidPlex est capable de fournir des lectures positives significatives pour toutes les cibles après incubation de l'échantillon de sérum COVID-19 positif pendant seulement 1 minute (figures 5C et S6) : Le maintien d'un signal élevé dans les échantillons de patients positifs démontre le grand potentiel de traduction future du dispositif SARS-CoV-2 RapidPlex en tant qu'outil de diagnostic à distance ultra-rapide au PS.
Pour étudier plus en détail la réponse du NP, S1-IgG, S1-IgM et CRP à l'infection par le CoV-2 du SRAS à l'aide de nos biocapteurs à base de LEG, nous avons mesuré chaque molécule cible dans des échantillons de sérum et de salive de sujets COVID-19 positifs et négatifs confirmés par RT-PCR. Les résultats obtenus ont été représentés sous forme de rapport entre les lectures ampérométriques pour chaque échantillon testé (S) et le blanc respectif (B) dans chaque cas afin de comparer la détection de la cible dans différentes gammes de concentration. En utilisant les capteurs au graphène, un total de 17 échantillons de sérum testés par COVID-19 RT-PCR (10 positifs, 7 négatifs) ont été analysés, et un total de 8 échantillons de salive testés par COVID-19 RT-PCR (5 positifs, 3 négatifs) ont été analysés (Tableau S1).
Les résultats des figures 5D et 5E corroborent que, comme prévu, par rapport aux sujets RT-PCR négatifs, les patients COVID-19 RT-PCR positifs présentent des niveaux significativement élevés des cibles sélectionnées dans les échantillons de sérum et de salive, avec des rapports S/B médians de 10,53, 11,62, 10,67 et 12,39 dans le sérum et de 2,81, 3,24, 1,62 et 1,76 dans la salive, pour le NP, le S1-IgG, le S1-IgM et le CRP, respectivement. Nous avons observé une concentration de NP comprise entre 0,1 et 0,8 μg mL-1 et 0,5 à 2,0 ng mL-1 dans le sérum et la salive du patient COVID-19, respectivement ; pour le S1-IgG, entre 20 et 40 μg mL-1 et 0,2-0.5 μg mL-1 dans le sérum et la salive de patients COVID-19, respectivement ; S1-IgM dans la fourchette de 20-50 μg mL-1 et 0,6-5,0 μg mL-1 dans le sérum et la salive de patients COVID-19, respectivement ; et CRP dans la fourchette de 10-20 μg mL-1 et 0,1-0,5 μg mL-1 dans le sérum et la salive de patients COVID-19, respectivement. Le fait que tous les échantillons positifs présentent des signaux beaucoup plus élevés que les échantillons négatifs prouve la réelle utilité de nos biocapteurs à base de LEG pour l'évaluation précise des biomarqueurs COVID-19 dans les fluides biologiques. En particulier, la présence significative observée des biomarqueurs COVID-19 dans la salive démontre l'utilité exceptionnelle de ce biofluide comme source précieuse pour le diagnostic et la surveillance non invasive de l'infection par le CoV-2 du SRAS.
Dans le but de confirmer la relation entre les niveaux de biomarqueurs inflammatoires impliqués dans la tempête de cytokines directement associés à la progression de la maladie, à sa gravité et à son issue dans COVID-19,57, 58, 59, 60, 61, 62, nous avons évalué la variation des niveaux de PCR sérique chez des sujets RT-PCR-négatifs (n = 7) et des patients COVID-19 RT-PCR-positifs qui ont été classés cliniquement selon la gravité de la maladie comme asymptomatiques (n = 2), légers (n = 5) et modérés (n = 2). Comme le montre la figure 5F, nous avons observé une association positive entre la concentration de PCR et le degré de gravité des symptômes de COVID-19, ce qui est conforme aux rapports récents de la littérature.20 , 61 De futurs tests cliniques utilisant des échantillons de salive et de sérum appariés au cours de l'infection sont nécessaires pour déterminer la relation entre les concentrations de salive et de sérum et pour valider l'utilité de notre plateforme dans l'identification de COVID-19 spécifique à la gravité (tableau 1).
Conclusions
Pour répondre à la demande croissante d'outils de diagnostic efficaces pour la détection simple de COVID-19 avec un délai de réponse immédiat, nous avons développé et mis en œuvre la première plateforme électrochimique multiplexée à base de graphène, SARS-CoV-2 RapidPlex, pour l'interrogation simultanée sensible, rapide et sélective de l'antigène viral NP, des isotypes S1-IgG et S1-IgM, et de la PCR dans les biofluides du sérum et de la salive de patients sains et infectés par COVID-19 confirmés par RT-PCR. La combinaison des propriétés avantageuses du matériel en graphène avec la haute sensibilité et la spécificité des stratégies d'immunodétection fait de notre plateforme SARS-CoV-2 RapidPlex un dispositif de diagnostic prometteur pour la surveillance précise de l'infection par COVID-19 dans le sérum et les liquides organiques accessibles de manière non invasive, sans avoir à recourir à un prétraitement complexe des échantillons. En raison de sa facilité d'utilisation, de la compatibilité des échantillons de salive et de la rapidité des résultats, la plateforme SARS-CoV-2 RapidPlex présente un fort potentiel de mise en œuvre au point de service pour le triage des patients, ainsi que pour une utilisation à domicile pour les soins de télémédecine et la surveillance à distance.
La surveillance de cibles sélectionnées dans le cadre d'une expérience unique et rapide (la capture des cibles peut être aussi brève qu'une minute) fournit des informations substantielles, non seulement sur l'infection précoce par COVID-19 grâce à la détection de l'antigène viral et de l'isotype IgM, mais aussi sur la gravité de la maladie grâce à l'évaluation de la PCR et sur l'immunité potentielle acquise grâce à la quantification de l'isotype IgG. L'évaluation rapide sur place de la gravité de la maladie, rendue possible par notre RapidPlex SARS-CoV-2, présente l'avantage sans précédent d'un triage COVID-19 immédiat. Dans les futures applications cliniques, cela pourrait non seulement alerter les médecins traitants des cas nécessitant une attention médicale importante et minutieuse, mais aussi faciliter l'allocation efficace de ressources médicales précieuses, telles que les ventilateurs et les lits de soins intensifs, en cas de résurgence des épidémies, afin d'optimiser les résultats pour les patients dans un contexte de surcharge des systèmes de santé locaux.
Les méthodologies que nous proposons, basées sur des techniques de fonctionnalisation de surface et des principes de détection simples mais bien établis, permettent de les transposer facilement à la détection d'autres rapporteurs hautement informatifs liés au SRAS-CoV-2, en changeant simplement le récepteur de capture du revêtement. D'autres améliorations technologiques pourraient être réalisées en introduisant un processus de manipulation des échantillons entièrement automatisé par le biais d'un module microfluidique pour le déploiement de la télémédecine. La modification de la conception de notre plateforme pourrait permettre de procéder rapidement à des tests de panel d'antigènes et d'anticorps viraux, de sorte que l'infection par le COVID-19 pourrait être clairement distinguée des symptômes non spécifiques des infections respiratoires saisonnières telles que la grippe. En outre, la plateforme de diagnostic de télémédecine sans fil, lorsqu'elle est associée à de nouveaux biocapteurs portables permettant de surveiller en permanence les signes vitaux et d'autres biomarqueurs chimiques, pourrait fournir des informations complètes sur l'état de santé d'un individu pendant la pandémie de COVID-19.63, 64, 65, 66, 67
Notre plateforme est pionnière dans la détection multiplexée de biomarqueurs spécifiques au stade du SRAS-CoV-2 afin de fournir un instantané détaillé et personnalisé de l'infection COVID-19. Nous croyons fermement que notre plateforme développée sera une méthode de test très utile pour lutter contre cette pandémie et les pandémies futures, contribuant à mettre fin à l'une des crises sanitaires, économiques et humanitaires mondiales les plus graves de l'histoire moderne.
