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#Actualités du secteur
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Imagerie cérébrale à super-résolution
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La lumière - et toutes les ondes - peut se courber autour des coins des obstacles qui se trouvent sur son chemin. En raison de ce phénomène, appelé diffraction, il est impossible de focaliser la lumière sur un point plus petit que la moitié de sa longueur d'onde. En d'autres termes, la plus haute résolution que l'on puisse théoriquement atteindre à l'aide d'un microscope optique est d'environ 250 nm, une barrière appelée limite de diffraction. Malheureusement, cette résolution n'est pas suffisante pour observer des structures cellulaires fines, comme celles que l'on trouve dans les neurones.
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Pendant plus d'un siècle, les microscopistes ont été paralysés par cet obstacle classique jusqu'à l'invention de la microscopie à fluorescence à super-résolution. Une approche particulièrement puissante a été développée à la fin des années 1990 et baptisée microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Cette technique exige que l'échantillon cible contienne des fluorophores, c'est-à-dire des composés qui absorbent la lumière à une longueur d'onde et la réémettent à une autre plus longue. Dans la version la plus simple de la microscopie STED, les fluorophores sont excités en un point circulaire par irradiation avec un laser focalisé limité par la diffraction. Ensuite, une partie en forme de beignet autour du point est irradiée avec une lumière moins énergétique - le faisceau d'appauvrissement - qui éteint la fluorescence par le processus d'émission stimulée. Ainsi, l'effet net est que seuls les fluorophores au centre du donut réémettent des photons, et comme cette zone peut être rendue arbitrairement petite, cela permet une microscopie à super-résolution.
Bien que la microscopie STED ait constitué une véritable percée dans l'observation de la morphologie des neurones vivants à une résolution supérieure, des améliorations sont encore possibles. Dans une étude récente publiée dans Neurophotonics, une équipe de scientifiques dirigée par le Dr U. Valentin Nägerl de l'Université de Bordeaux a mis au point une méthode de calibrage simple mais efficace qui permet une imagerie STED plus précise à des profondeurs de tissus plus élevées. Leur approche est basée sur l'analyse et la correction de l'une des principales sources d'erreur systématique en microscopie STED pour les échantillons biologiques : l'aberration sphérique du faisceau de déplétion.
Lors de l'imagerie d'un échantillon de tissu à des profondeurs supérieures à 40 μm, le faisceau de déplétion subit divers types de défocalisation et de dégradation (aberration) et perd sa forme soigneusement élaborée, qui est essentielle à la méthode STED. L'aberration sphérique est le plus grand coupable et c'est elle que les chercheurs ont ciblée. Leur stratégie a consisté à préparer d'abord un échantillon de tissu cérébral fantôme, un substitut à base de gel dont l'indice de réfraction est similaire à celui du cerveau réel. Cet échantillon fantôme contenait des fluorophores et des nanoparticules d'or dispersés de manière homogène, ce qui a permis à l'équipe de visualiser et de quantifier clairement la façon dont la forme du faisceau d'appauvrissement se déforme à mesure qu'il pénètre en profondeur. Ils ont ensuite calculé les ajustements préalables nécessaires à apporter au faisceau d'appauvrissement en fonction de la profondeur des tissus, afin que sa forme finale corresponde davantage à la forme idéale. Les ajustements ont été effectués à l'aide de l'optique adaptative, une technologie développée à l'origine par les astronomes pour améliorer les images télescopiques qui souffrent d'aberrations causées par l'atmosphère terrestre.
Une fois la forme du faisceau d'épuisement calibrée en fonction des tests sur les fantômes, les scientifiques ont procédé à l'imagerie de tissus neuronaux vivants. Ils ont comparé les résultats de la microscopie STED ordinaire, de la microscopie STED corrigée et de la microscopie à deux photons, une technique spécifiquement adaptée à l'imagerie des tissus profonds. Les résultats ont été tout à fait convaincants : les images STED corrigées capturaient les détails fins des dendrites neuronaux plus profonds bien mieux que les images STED standard. "Grâce à notre stratégie d'étalonnage, nous avons pu mesurer des structures neuronales aussi petites que 80 nm à une profondeur de 90 μm à l'intérieur du tissu biologique et obtenir une augmentation du signal de 60 % après correction de l'aberration sphérique", déclare Nägerl.
Ji Yi, professeur d'ingénierie biomédicale à l'université Johns Hopkins, remarque : "La microscopie à super-résolution a été principalement appliquée à des spécimens minces, tels que des cellules à une seule couche, où la diffusion de la lumière est négligeable. L'équipe dirigée par Valentin Nägerl a mis en œuvre l'optique adaptative dans une microscopie à déplétion par émission stimulée à deux photons (2P-STED) et a obtenu une résolution de 80 nm pour l'imagerie des épines dendritiques des neurones à travers un tissu cérébral de 90 microns. Ce résultat est remarquable car la super-résolution est difficile à maintenir dans des tissus plus épais, notamment en raison de la qualité de diffusion élevée du tissu cérébral." M. Yi explique que cette avancée facilitera l'étude des activités et des interactions neuronales.
Ce nouveau processus d'étalonnage étant robuste, simple à mettre en œuvre et relativement peu coûteux, il pourrait être facilement intégré aux pratiques de laboratoire standard afin d'obtenir de meilleurs résultats avec les microscopes STED, pour autant que l'échantillon fantôme préparé corresponde aux propriétés optiques du spécimen biologique. À cet égard, Nägerl déclare : "Notre approche n'est pas limitée aux échantillons de cerveau ; elle pourrait être adaptée à d'autres tissus dont les indices de réfraction sont connus et relativement homogènes, ainsi qu'à d'autres types de préparations, même potentiellement dans le cerveau intact et vivant de la souris."