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Un nouvel outil de simple-molécule pour observer des enzymes au travail

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Une équipe de scientifiques à l'université de Washington et la compagnie de biotechnologie Illumina ont créé un outil innovateur pour détecter directement les interactions sensibles, de simple-molécule entre l'ADN et les protéines enzymatiques.

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Leur approche fournit une nouvelle plate-forme pour regarder et enregistrer ces interactions de nanoscale en temps réel. Car elles rapportent septembre 28 en biotechnologie de nature, cet outil devrait fournir la caractérisation rapide et fiable de l'utilisation cellulaire de protéines de différents mécanismes de lier aux rives d'ADN -- l'information qui pourrait jeter la nouvelle lumière sur atomique-mesurent des interactions dans nos cellules et aident à concevoir de nouvelles thérapies de drogue contre des microbes pathogènes par l'optimisation des enzymes qui agissent l'un sur l'autre avec de l'ADN.

« Il y a d'autres outils de simple-molécule autour, mais notre nouvel outil est bien plus sensible, » a dit professeur aîné Jens Gundlach d'auteur et de physique d'UW. « Nous pouvons vraiment reprendre atomique-mesurons les mouvements qu'une protéine donne sur l'ADN. »

Comme peut se produire dans le processus scientifique, ils ont développé cet outil -- les brucelles de nanopore de picometer-résolution de simple-molécule, ou SPRNT -- tout en travaillant sur un projet relatif.

L'équipe d'UW avait exploré la technologie de nanopore pour lire des ordres d'ADN rapidement. Nos gènes sont de longs bouts droits des molécules d'ADN, qui se composent des combinaisons quatre d'ADN chimique « lettres. » Dans leur approche, Gundlach et son équipe mesurent un courant électrique par un pore biologique appelé MspA, qui est enfoncé dans une membrane modifiée de cellules. Comme l'ADN traverse une ouverture minuscule dans le pore -- une ouverture qui est de juste 0.00000012 centimètre de large, ou 1/10,000th la largeur des cheveux humains -- les décalages de courant basés sur l'ordre des lettres d'ADN. Elles emploient ces changements du courant pour impliquer des ordres d'ADN.

Gundlach et son équipe, en cours de nanopore de investigation ordonnançant, ont essayé une série de moteurs moléculaires pour déplacer l'ADN par le pore. Ils ont découvert que leur installation expérimentale était assez sensible pour observer des mouvements beaucoup plus petits que la distance entre les lettres adjacentes sur l'ADN. Comme ils rapportent en leur papier, SPRNT est plus de sept fois plus sensible que des techniques existantes aux interactions de mesure entre l'ADN et les protéines.

« Généralement, la plupart des techniques existantes pour regarder des mouvements de simple-molécule -- comme les brucelles optiques -- ayez une résolution, au mieux, d'environ 300 picometers, » a dit Gundlach. « Avec SPRNT, nous pouvons avoir la résolution de 40 picometer. »

Pour la référence, 40 picometers sont de 0.000000004 centimètre, ou environ 0.0000000016 pouce.

« Nous avons réalisé que nous pouvons détecter des différences minutieuses en position de l'ADN dans le pore, » a dit le chercheur post-doctoral Andrew Laszlo, un co-auteur de physique d'UW sur le papier. « Nous pourrions prendre des différences dans la façon dont les protéines liaient à l'ADN et la déplaçaient par le pore. »

Ces différences expliquent le rôle unique les jeux cellulaires de chaque protéine pendant qu'il agit l'un sur l'autre avec de l'ADN. Les cellules ont des protéines pour copier l'ADN, ADN « lue » pour exprimer des gènes et pour réparer l'ADN quand elle est endommagée. Il y a des protéines cellulaires qui déroulent l'ADN, alors que d'autres lient l'ADN étroitement ensemble.

Les biologistes ont longtemps identifié que les protéines ont différentes structures pour exécuter ces rôles, mais il a été difficile détecter le mouvement physique des protéines pendant qu'ils travaillent à l'ADN directement.

« Quand vous avez le genre de résolution que SPRNT offre, vous pouvez commencer à sélectionner à part les étapes de minute prise de ces protéines, » a dit Laszlo.

Gundlach et son équipe prouvent que SPRNT est assez sensible pour différencier entre les mécanismes que deux protéines cellulaires emploient pour passer à ADN par l'ouverture de nanopore. Une protéine, qui copie normalement l'ADN, se déplace le long de la lettre d'ADN une à la fois en tant qu'elle guide l'ADN par le pore. La deuxième protéine, qui déroule normalement l'ADN, au lieu de cela prend deux mesures le long de chaque lettre d'ADN, qu'elles pourraient prendre en dépistant les changements minutieux du courant, selon l'étudiant doctoral Jonathan Craig de co-auteur et de physique d'UW. Ils ont même découvert que ces deux étapes comportent les processus chimiques séquentiels que la protéine emploie pour marcher le long de l'ADN.

« Vous pouvez vraiment voir les mécanismes fondamentaux, et cela a une tonne d'implications -- de l'arrangement comment les travaux de vie à la conception de drogue, » ont indiqué Laszlo.

Gundlach croit que cet outil peut ouvrir une nouvelle fenêtre pour l'arrangement comment les protéines cellulaires traitent l'ADN, qui pourrait aider génétiquement des protéines d'ingénieur pour effectuer les travaux originaux. Ces détails fins peuvent également aider des scientifiques à comprendre comment les mutations en protéines peuvent mener à la maladie ou trouver les propriétés de protéine qui seraient les cibles idéales pour des thérapies de drogue.

« Par exemple, le code viral de gènes pour leurs propres protéines qui traitent leur ADN, » a indiqué Gundlach. « Si nous pouvons employer SPRNT pour examiner pour les drogues qui perturbent spécifiquement le fonctionnement de ces protéines, il peut être possible d'interférer des virus. »