Comment préparer rapidement des échantillons de suspension de cellules nerveuses de rat ou de souris de haute qualité ?

Les neurones (également appelés neurones ou cellules nerveuses) sont les unités fondamentales du cerveau et du système nerveux, l'isolement et la culture de neurones in vitro se sont révélés être une approche très puissante pour aborder le processus

Les cultures de neurones primaires sont de puissants systèmes modèles utilisés pour étudier la morphologie et la différenciation des neurones, la fonction synaptique et la libération de neurotransmetteurs, la neurotoxicité pendant le développement préclinique de médicaments et la modélisation de maladies. Comme les neurones ne se divisent pas et ne prolifèrent plus après la séparation, établir une méthode simple, reproductible et rentable pour isoler et cultiver les cellules nerveuses primaires ferait grandement progresser la recherche en neurosciences.

Cependant, les neurones primaires sont très sensibles aux conditions d'isolement et à leur environnement de culture ou de croissance. Étant donné que les méthodes diffèrent d'un laboratoire à l'autre, les rendements cellulaires, la viabilité et les taux de maturation sont très variables et rendent difficile la comparaison des résultats et la répétition des expériences entre les laboratoires.

Alors, comment préparer rapidement des échantillons de suspension de cellules nerveuses de rat/souris de haute qualité ?

Comparativement aux souris nouveau-nées, la dissociation du cerveau de rat adulte est plus complexe, nécessitant une combinaison d'hydrolyse mécanique et enzymatique pour dégrader la matrice extracellulaire. En règle générale, l'élimination de la myéline nécessite une période d'incubation prolongée avec des enzymes de digestion, une désintégration mécanique sévère et/ou des étapes supplémentaires pour la purification de la myéline, ce qui compromet complètement la récupération et la viabilité des suspensions cellulaires primaires.

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour isoler les cellules neurales de souris à l'aide d'une formulation d'enzymes de digestion tissulaire douce. Les instruments expérimentaux détaillés, les matériaux et la procédure expérimentale sont répertoriés comme suit.

Instruments et matériaux expérimentaux

Dissociateur de suspension à cellule unique RWD DSC-400 ;

RWD HJ-400 Veste chauffante ;

RWD DHABE-5003 Kit de digestion enzymatique cérébrale adulte à haute activité (souris et rat) ;

RWD SCT-100 Tube de traitement des tissus ;

Filtre cellulaire 70μm;

RWD Animal instrument chirurgical;

Fournitures de culture cellulaire; Pipette.

Procédure expérimentale

Selon les instructions, mélanger l'enzyme MIX et l'activer avec un bain-marie à 37℃.

Les tissus cérébraux de rats adultes (P>7) ont été disséqués et stockés temporairement dans des boîtes de Pétri contenant du HBSS (Ca2+ et Mg2+). Les vaisseaux sanguins des tissus cérébraux ont été délicatement retirés autant que possible avec des pincettes

Mettez le tissu cérébral et l'enzyme MIX dans le tube de traitement des tissus et coupez le cerveau entier en 4 morceaux avec des ciseaux.

Inversez le tube de traitement des tissus vers le dissociateur de suspension à cellule unique, installez la veste chauffante et exécutez le programme M_ABrain_Heater_2.

Les échantillons de suspension cellulaire ont été filtrés avec un filtre cellulaire et centrifugés pendant 10 min à 300 x g à température ambiante.

6. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml, ajoutez le réactif de défragmentation, mélangez bien, posez la couche supérieure avec du PBS pré-refroidi et faites tourner à 3000 × g pendant 10 min à 4 ℃ avec accélération 5 et accélération 3. Le garder la couche inférieure de culots cellulaires, laver et recueillir.

7. Opération de crack rouge (facultatif).

8. Numération cellulaire et cytométrie en flux

Les cellules du tissu cérébral de souris adulte traitées par un appareil de dissociation de suspension à cellule unique RWD peuvent atteindre une viabilité cellulaire de 90 %, ce qui est un pourcentage idéal pour l'expérience en aval. RWD DHABE-5003 Le kit d'enzymolyse douce de tissu cérébral adulte de souris peut être utilisé pour le dissociateur de suspension cellulaire unique de tissu cérébral entier de rat ou de souris adulte (P> 7). Il peut également prendre en charge l'isolement de toutes les cellules neurales et non neurales dans le cerveau.