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En savoir plus sur la photométrie à fibre : principe de fonctionnement et processus
Cet article contient plus de 3 000 mots pour expliquer le principe de fonctionnement et les avantages, et montre les étapes de mise en place de l'expérience pertinente.
A. Principe de fonctionnement de la photométrie à fibre.
B. Avantages de la photométrie des fibres.
C. Comment utiliser la technologie de photométrie à fibre ?
D. Configuration du système de photométrie à fibre et enregistrement d'un bon signal.
F. Analyse des données de photométrie des fibres.
A. Photométrie à fibre Principe de fonctionnement
Le cerveau humain compte environ 90 milliards de neurones, qui sont interconnectés par des synapses pour former un réseau neuronal complexe, et produisent ainsi diverses fonctions complexes. Le cerveau peut synthétiser et libérer des centaines de neurotransmetteurs, et les signaux nerveux sont transmis entre les neurones par les neurotransmetteurs libérés par les synapses. Lorsque l'excitation nerveuse est transmise à l'extrémité de la synapse, elle stimulera le canal calcique de la synapse pour qu'il s'ouvre et favorise l'afflux d'ions calcium, et la concentration d'ions calcium intracellulaires augmentera instantanément, entraînant la libération de neurotransmetteurs par les vésicules synaptiques. dans l'espace synaptique, et qui va se lier aux récepteurs de la membrane post-synaptique et transmettre les signaux des neurotransmetteurs au neurone suivant, transmettant ainsi l'information étape par étape
Prenant la détection du signal de fluorescence du calcium comme exemple, le principe technique du système de photométrie à fibre consiste à utiliser un indicateur fluorescent spécial ou une sonde de fluorescence à l'aide de la correspondance stricte entre le changement de concentration en calcium et l'activité neuronale. La concentration de calcium dans le neurone est exprimée par l'intensité de fluorescence et capturée par le système de photométrie à fibre, de manière à atteindre l'objectif de détection de l'activité neuronale.
Dans le système nerveux, la concentration de calcium intracellulaire des neurones à l'état de repos est de 50 à 100 nM, mais lorsque les neurones sont excités, la concentration de calcium intracellulaire peut augmenter de 10 à 100 fois, nous pouvons donc marquer les ions calcium en injectant des indicateurs de codage du gène du calcium ( Indicateur de calcium, tel que GCaMPs, RCaMPs, etc.). Lorsque l'activité neuronale est améliorée, le canal calcique s'ouvre, une grande quantité d'afflux de calcium et se lie à CaM, entraînant l'interaction entre les domaines M13 et CaM, conduisant à cpEGFP structurel réarrangement, améliorant ainsi le signal de fluorescence verte. (Figure 1) Par conséquent, nous pouvons caractériser l'activité des neurones en détectant les changements de signaux calciques, puis étudier la corrélation entre l'activité neuronale et le comportement animal, et explorer le mécanisme de régulation derrière un comportement complexe .
Le principe de la photométrie à fibre pour la détection des signaux des neurotransmetteurs est le même que ci-dessus. Une nouvelle série de sondes fluorescentes génétiquement codables, appelées GRAB (GPCR activation-based), a été développée. En intégrant une protéine fluorescente (cpEGFP) sensible aux changements structurels dans le récepteur du neurotransmetteur, le groupe de recherche a pu convertir le signal chimique du neurotransmetteur en un signal fluorescent et, en combinaison avec les techniques d'imagerie existantes, surveiller les changements dynamiques de la concentration du neurotransmetteur. en temps réel
B. Avantages de la photométrie à fibre
L'étude du système nerveux des animaux éveillés et en mouvement libre est un enjeu crucial de la recherche contemporaine en neurosciences. En détectant les signaux calciques associés à l'activité neuronale, nous sommes en mesure de mieux comprendre les circuits neuronaux complexes. Ces dernières années, les développements technologiques, notamment la microscopie à deux photons, la microscopie à photon unique et la photométrie à fibre, nous ont permis d'effectuer une détection en temps réel des changements dans les signaux calciques chez les animaux. L'application de ces techniques nécessite des protéines fluorescentes modifiées.
Dans le passé, la plupart des images calciques in vivo étaient réalisées sous microscopie à deux photons. La microscopie à deux photons est une technique d'imagerie par fluorescence dans laquelle deux faisceaux de lumière laser cohérente sont focalisés à travers l'oculaire d'un microscope vers un point défini par une fonction d'étalement ponctuel, similaire à la microscopie confocale qui excite sélectivement des molécules de type fluorescent. En microscopie à deux photons, la longueur d'onde de la lumière d'excitation est proche de 700-1000 nm, proche du spectre infrarouge. C'est le premier avantage de l'imagerie biphotonique in vivo : les longueurs d'onde plus longues de la lumière diffusent moins dans les tissus et pénètrent plus profondément. La seconde est la bonne résolution qui permet de visualiser non seulement les neurones individuels mais aussi l'activité calcique aux extrémités des axones des structures subcellulaires.
Les techniques de balayage laser en microscopie à deux photons sont également utilisées pour détecter la dynamique rapide du calcium dans les neurones pendant l'imagerie in vivo, mais la puissance d'excitation pour distinguer le signal du bruit doit généralement être suffisamment élevée pour que cela provoque un certain degré de blanchiment, et les délais de photoblanchiment peuvent affecter négativement la qualité de l'image.
