Comment procéder à la micro-injection de Caenorhabditis Elegans ? Ne manquez pas les détails étape par étape !

La micro-injection de C Elegans est la technique de base du paradigme de recherche de C Elegans. Consultez les détails de la procédure expérimentale, étape par étape !

Contexte de la micro-injection de C Elegans

Caenorhabditis elegans (c elegans) est un organisme modèle important utilisé pour étudier la génétique animale, l'ontogenèse et l'éthologie. Il peut nous aider à étudier le mécanisme d'action depuis le niveau moléculaire et cellulaire jusqu'au niveau biologique du système en ce qui concerne le cycle de vie correspondant. La technologie de micro-injection fournit un tube de verre capillaire dont l'extrémité a un diamètre de quelques millimètres pour l'injection d'acides nucléiques dans la gonade du ver qui sont ensuite absorbés par les ovules et générés sous la forme de matrices extrachromosomiques. La micro-injection de C elegans est la technique de base du paradigme de recherche sur C elegans. Elle est largement utilisée pour étudier l'expression des gènes, la fonction des gènes et les interactions génétiques à l'intérieur du corps de C elegans.

Protocole de micro-injection de C elegans

Etape 1 : Préparation des plaques de gélose

Déposez 50ul de solution d'agarose chaude à 2% sur une lamelle de verre de 24 × 60 mm et posez délicatement une autre lamelle par-dessus (attention aux bulles d'air). Une fois que l'agarose aplati s'est solidifié (~5 min), vous pouvez retirer la lamelle sur le dessus en la faisant glisser doucement. Laissez la plaque d'agarose sécher toute la nuit à température ambiante ou faites-la cuire au four à 80℃ pendant 1 heure. Empilez les plaques pour une utilisation ultérieure

Étape 2 : Préparation des aiguilles

L'aiguille est la clé de la réussite de la micro-injection de C elegans. L'extracteur de micropipettes RWD aide à générer 2 aiguilles aux performances stables et constantes. Il est recommandé d'utiliser le tube de verre capillaire RWD pour le tirage de la pipette afin de remplir rapidement l'extrémité des aiguilles avec la solution mère. Ainsi, les bulles d'air peuvent être évacuées. En général, les diamètres des pointes sont inférieurs à 1μm et la longueur du cône est d'environ 5~7mm.

Étape 3 : Préparation de l'ADN et remplissage d'une pipette à chargement par aiguille

Selon les exigences expérimentales, choisissez les substances pour la solution mère. Par exemple, l'ADN, l'ARN, les protéines et d'autres substances. La pureté de la solution mère est l'un des facteurs importants affectant l'efficacité de l'injection. Utilisez un compte-gouttes chimique petit et fin pour introduire la solution mère dans la pipette par l'extrémité des aiguilles. Après plusieurs minutes, observez la pointe pour voir s'il y a des bulles d'air

Étape 4 : Rupture

Placez le lamelle couvre-objet sur la plaque de gélose remplie de solution mère. Déplacez le micromanipulateur RWD pour briser l'aiguille contre le bord de la lame de verre. Lorsque l'aiguille est cassée, la vacuole s'échappe. Cette méthode permet une pénétration facile de l'aiguille dans le ver

Étape 5 : Montage des vers

Les jeunes vers gravides sont couramment sélectionnés pour la micro-injection car leurs gonades sont complètement développées à ce stade où les vers sont facilement sujets à la transfection de l'ADN, ce qui permet de générer une descendance transgénique. Utilisez un pic pour placer le ver sur la plaque de gélose. Ajustez la position de façon à ce que la gonade soit exposée à l'extérieur. Ajoutez quelques gouttes d'huile halocarbonée pour recouvrir entièrement le ver.

Étape 6 : Micro-injection

Placez la plaque de gélose sur la platine mécanique. Trouvez le ver sous le microscope et faites la mise au point sur la gonade en ajustant la lentille du condenseur. Utilisez le micromanipulateur RWD pour insérer l'aiguille dans la gonade. Mettez en marche la pompe de micro-injection RWD Nanoliter pour commencer l'injection

Étape 7 : Récupération des vers

Ajoutez quelques gouttes de solution tampon au ver injecté sous le stéréomicroscope. Après 2 à 5 minutes, le ver redevient actif. Il doit commencer à nager et à bouger sa tête d'un côté à l'autre. À ce moment-là, vous pouvez le transférer à nouveau dans les plaques de culture cellulaire pour une culture régulière à 20℃.

Précautions[2]

Plaques d'agar : Si le ver meurt rapidement sur la plaque de gélose, cela indique que la plaque est trop sèche. Dans ce cas, elle peut être remplacée par une autre plaque avec une couche d'agar plus fine puisque l'agarose sert principalement à absorber l'eau du ver ; Si le ver ne peut pas adhérer fermement à la plaque, cela implique que la plaque est trop humide ou trop fine. Dans ce cas, il est conseillé de la mettre au four pendant un certain temps ou de coller le ver sur la plaque avant d'ajouter l'huile halocarbonée

Substances à injecter : Gardez la solution d'ADN bien mélangée et centrifugée avant l'injection pour éviter que la pointe de l'aiguille ne se bouche. La concentration d'ADN doit rester inférieure à 200 mg/l car une solution d'ADN très concentrée produira des toxines et entraînera une surexpression des gènes

Orientation de l'injection : L'aiguille et la gonade doivent être positionnées selon un angle aigu. Il est recommandé de placer l'aiguille horizontalement ou à un angle de 15° par rapport à la tête ou à la queue.

Échantillon utilisé dans l'expérience : Assurez-vous que les vers injectés sont bien nourris et en bonne santé.

Taux de mortalité élevé des vers injectés : Pour la récupération des vers, si le temps est trop long ou trop court, cela peut être dû à une aiguille trop grosse ou à une contamination de l'ADN injecté. Pour résoudre ce problème, une aiguille plus fine pourrait être le remède. Essayez également d'injecter une seule gonade à la fois. Si la procédure de micro-injection a été effectuée correctement mais qu'aucun ver transgénique n'apparaît, les raisons possibles peuvent être la létalité induite par la transformation génétique ou la pollution des acides nucléiques injectés qui nécessite une nouvelle purification

Références :

[1] Matthias Rieckher et Nektarios Tavernarakis. Génération d'animaux transgéniques Caenorhabditis elegans par micro-injection d'ADN [J].Bio Protocol, 2017, 7(19) : e2565.

[2] Krishna S. Ghanta et al, Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans [J].Star Protocols, 2021, 2(3) : 100748.