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Percée innovante : Modèle murin pour l'évaluation rapide de l'activité des médicaments anti-Mycobacterium tuberculosis par inhalation

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Un nouveau modèle murin non invasif utilisant des M. tuberculosis autoluminescents permet une évaluation rapide de l'efficacité des médicaments antituberculeux inhalés par la mesure de la RLU.

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En raison des caractéristiques pharmacocinétiques sous-optimales des voies orales ou injectables conventionnelles, l'efficacité de la plupart des composés contre Mycobacterium tuberculosis (MTB) est souvent limitée par une distribution et un métabolisme inefficaces du médicament. Afin d'améliorer les concentrations de médicaments localisées dans les poumons, l'administration par inhalation est devenue une priorité de recherche, permettant une administration ciblée afin d'augmenter directement l'exposition aux médicaments sur les sites d'infection. Cependant, les modèles existants reposent principalement sur des souches de MTB de type sauvage, qui souffrent d'une complexité opérationnelle, de délais d'expérimentation prolongés, de coûts de main-d'œuvre élevés et d'une reproductibilité médiocre.

Dans cette étude, Tian X, Gao Y, Ma W et leurs collègues ont mis au point un modèle d'évaluation basé sur l'inhalation et utilisant des souches autoluminescentes de Mycobacterium tuberculosis (AIRv). Ce modèle surveille dynamiquement l'activité du médicament en quantifiant les unités de lumière relative (ULR) émises par des souris vivantes infectées par la souche autoluminescente. Cette approche innovante présente les avantages suivants :

1. Procédures simplifiées : Il n'est pas nécessaire d'anesthésier les souris, ce qui simplifie l'administration des médicaments et l'utilisation des instruments.
2. Rentabilité : Remplace les grands modèles animaux par des souris, ce qui réduit considérablement les coûts d'expérimentation.
3. Calendrier accéléré : La période d'évaluation traditionnelle est ramenée de plusieurs mois à 16-17 jours.
4. Évaluation non invasive : Utilise des UCR vivantes comme substitut des unités formant des colonies (UFC), évitant ainsi le sacrifice d'animaux.
5. Capacité à haut débit : Permet l'administration quotidienne simultanée à six souris, avec la possibilité d'administrer 2 à 3 doses par jour.
6. Fiabilité accrue : Les mesures objectives de la RLU minimisent l'intervention humaine et améliorent la reproductibilité.

Les expériences de validation du concept ont démontré que la rifampicine, l'isoniazide et l'éthambutol inhalés présentaient une puissante activité antituberculeuse à de faibles concentrations (0,5, 0,5 et 0,625 mg/mL, respectivement), les résultats de la RLU étant en étroite corrélation avec l'efficacité thérapeutique. Une validation plus poussée a confirmé un rapport constant (~10:1) entre les RLU pulmonaires et les CFU, ce qui renforce le rôle des RLU en tant qu'indicateur fiable de l'efficacité. Cette méthode constitue une plateforme efficace et précise pour l'évaluation rapide de l'activité des médicaments inhalés in vivo.

Méthodes expérimentales

1. Souche et culture :

La souche autoluminescente de Mycobacterium tuberculosis (AIRv), portant le groupe de gènes luxCDABE, a été cultivée dans le bouillon Middlebrook 7H9 jusqu'à ce qu'elle atteigne la phase de croissance logarithmique (OD600 = 0,6-0,8 ; RLUs ≈ 5 × 10⁹/mL).

2. Établissement du modèle animal

2.1 Infection : Des souris BALB/c femelles ont été infectées par AIRv via un système d'inhalation d'aérosols et divisées au hasard en groupes (6 souris par groupe).
2.2 Charge bactérienne initiale : Le troisième jour (expérience 1) ou le premier jour (expérience 2) après l'infection, les souris ont été anesthésiées pour la détection de la RLU thoracique. Un sous-ensemble de souris a été euthanasié et les homogénats pulmonaires ont été analysés pour les RLU et les CFU (via des plaques de gélose 7H10 avec une incubation de 4 semaines) afin d'évaluer les niveaux d'infection de base.

3. Administration du médicament par inhalation

Les médicaments (rifampicine [RIF], isoniazide [INH] et éthambutol [EMB]) dissous dans de l'eau stérilisée (gamme de doses : 0,125-10 mg/mL) ont été nébulisés et administrés quotidiennement à l'aide d'un appareil d'exposition nasale (Tow Systems Nose-Only). Chaque séance de traitement a duré de 20 à 25 minutes et s'est poursuivie pendant 14 à 15 jours.

4. Évaluation de l'efficacité

4.1 RLUs en direct : Les RLU ont été mesurées de manière non invasive dans la région thoracique de souris vivantes à l'aide d'un luminomètre (GLOMAX 20/20) pour la surveillance dynamique de l'efficacité du médicament.
4.2 Analyse terminale : Après l'expérience, les souris ont été euthanasiées. Les RLU et les CFU de l'homogénat pulmonaire ont été quantifiés pour valider leur corrélation (rapport approximatif : 10:1).

5. Études pharmacocinétiques

5.1 Échantillonnage : Le plasma et les tissus pulmonaires ont été prélevés à des moments précis après l'inhalation. Les concentrations de médicament ont été déterminées par chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC-MS).
5.2 Calcul des paramètres : Les paramètres pharmacocinétiques, y compris l'aire sous la courbe (AUC) et la demi-vie (t₁/₂), ont été analysés pour évaluer la rétention et l'efficacité du médicament dans les tissus pulmonaires.

Résultats expérimentaux

1. Validation de l'efficacité du modèle murin

Forte corrélation entre les unités lumineuses relatives et les UFC : Les unités de lumière relative (ULR) de Mycobacterium tuberculosis autoluminescent (AIRv) dans les poumons présentaient un rapport constant d'environ 10:1 avec les unités formant des colonies (UFC) (p<0,0001), ce qui confirme que les ULR sont un marqueur de substitution fiable pour l'évaluation rapide de l'efficacité des médicaments.

2. Évaluation de l'activité du médicament

2.1 Expérience à dose unique : la rifampicine (RIF 2 mg/mL), l'isoniazide (INH 2 mg/mL) et l'éthambutol (EMB 10 mg/mL) ont réduit de manière significative à la fois les URL et les UFC pulmonaires par rapport au contrôle par solvant (p<0,0001).l'INH à la dose élevée (2 mg/mL) a presque éradiqué les bactéries, avec des UFC proches de zéro.

2.2 Activité dépendante de la dose : Rifampicine : Seule la dose la plus élevée (2 mg/mL) a montré une inhibition bactérienne significative (p<0,0001), alors que les doses plus faibles (0,5 et 0,125 mg/mL) ont été inefficaces. Isoniazide : Les doses de 2 mg/mL et de 0,5 mg/mL ont réduit de manière significative la charge bactérienne (p<0,0001), tandis que la dose de 0,125 mg/mL n'a pas eu d'effet.Ethambutol : Les doses de 10 mg/mL et de 2,5 mg/mL ont nettement réduit les UCR et les UFC (p<0,0001), tandis que la dose la plus faible (0,625 mg/mL) s'est révélée moins efficace (p<0,05).


3. Propriétés pharmacocinétiques

3.1 Absorption rapide : Rifampicine (2 mg/ml) : La concentration plasmatique maximale (16,65 ± 3,91 μg/mL) et la concentration dans les tissus pulmonaires (2,33 ± 0,89 μg/g) ont été atteintes dans les 5 minutes suivant l'inhalation. Isoniazide (0,5 mg/mL) : Les concentrations pulmonaires ont chuté à des niveaux quasi indétectables en 30 minutes, ce qui a nécessité l'administration de plusieurs doses quotidiennes. Éthambutol (10 mg/mL) : La concentration pulmonaire maximale a atteint 10,94 ± 1,63 μg/g, maintenant des niveaux efficaces (>10 heures).

3.2 Rétention prolongée:La rifampicine et l'éthambutol ont maintenu des concentrations efficaces dans le tissu pulmonaire pendant 24 heures et 10 heures, respectivement, dépassant de manière significative leurs concentrations minimales inhibitrices (CMI) in vitro.

Conclusion
En intégrant des souches bactériennes autoluminescentes à la technologie d'administration par inhalation, ce modèle permet une évaluation rapide et précise de l'activité des médicaments antituberculeux. Il améliore considérablement l'efficacité du développement des médicaments et fournit un soutien technique essentiel pour la mise au point de nouveaux schémas thérapeutiques.

Système d'exposition par inhalation uniquement par le nez Tow-Int Tech

Dans cette étude, le système d'exposition par inhalation uniquement par le nez de Tow-Int Tech a été utilisé pour administrer des thérapies inhalées (par exemple, la rifampicine) à des souris. Les résultats ont démontré que cette approche basée sur l'inhalation améliore de manière significative l'efficacité thérapeutique par rapport aux voies traditionnelles orales ou injectables, améliorant ainsi l'efficacité du développement des médicaments.

Le système d'exposition par inhalation nez/bouche est conçu pour l'administration précise de médicaments par voie orale/nasale et pour les expériences d'exposition par inhalation chez les animaux de laboratoire tels que les souris, les rats et les cochons d'Inde. Doté d'une conception étanche et d'une concentration d'exposition uniforme, le système est idéal pour les études d'inhalation utilisant des aérosols liquides, des aérosols de poussière, des aérosols de nanoparticules, de la fumée et d'autres agents inhalables. Il garantit un dosage cohérent entre les animaux d'un même groupe expérimental, permet de contrôler en temps réel la concentration d'aérosols et de prélever des échantillons, et intègre un système de contrôle de haute précision pour maintenir l'homogénéité et la stabilité de l'exposition.

En outre, le système permet de tester diverses substances, notamment des produits pharmaceutiques, des polluants atmosphériques (p. ex. PM2,5), des composés organiques, des produits chimiques industriels et des agents agricoles. Il s'adapte à divers protocoles expérimentaux tels que l'exposition aiguë/chronique, les conditions de basse/haute pression et les environnements hypoxiques/hyperoxiques, offrant ainsi une grande flexibilité pour la recherche toxicologique et pharmacologique avancée.

Références :
[1]Tian X, Gao Y, Ma W, et al. Establishment of an Inhalation Administration Non-invasive Murine Model for Rapidly Testing Drug Activity against Mycobacterium tuberculosis [J]. bioRxiv, 2024 : 2024.02. 27.582260.
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