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Utilisation de la pléthysmographie du corps entier pour étudier et surveiller les mécanismes de la toux chez la souris

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Pléthysmographie du corps entier pour la recherche sur le comportement de la toux chez la souris

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Résumé

La toux est un mécanisme de défense respiratoire essentiel qui permet d'éliminer le mucus ou les substances étrangères des voies respiratoires. Dans des conditions normales, il s'agit d'une réponse physiologique puissante et efficace. Cependant, dans les états pathologiques, les mécanismes neuronaux qui contrôlent ces comportements défensifs peuvent devenir hypersensibles, entraînant une toux sèche chronique qui affecte gravement la qualité de vie. Bien que la toux soit un motif fréquent de consultation médicale, les traitements actuels restent limités et peuvent conduire à l'abus de médicaments, en grande partie à cause d'une compréhension insuffisante des mécanismes neuronaux et moléculaires qui sous-tendent le comportement de la toux.

Une étude novatrice menée par l'équipe du professeur Luo Fujun du laboratoire de Guangzhou, publiée dans eLife, a identifié un circuit du tronc cérébral qui contrôle les comportements défensifs des voies respiratoires chez la souris, semblables à la toux. Le premier auteur, le professeur Xu Xiaoshan, a utilisé un modèle de souris se déplaçant librement pour révéler le circuit neuronal du tronc cérébral médiant les réflexes respiratoires évoqués, les définissant comme une réponse semblable à la toux. En employant de multiples techniques de cartographie et de modulation des circuits neuronaux, l'équipe a découvert un rôle précédemment méconnu du noyau spinal trigéminal caudal (SP5C) dans le comportement de toux réflexe.

Cette étude a combiné la pléthysmographie du corps entier (WBP), l'enregistrement audio et les technologies de suivi vidéo développées par Tow-Int Tech afin d'établir un paradigme quantitatif pour étudier le comportement de la toux chez des souris éveillées. En utilisant des souris transgéniques TRAP2 et la photométrie à fibre in vivo, les chercheurs ont démontré que l'activité neuronale dans le SP5C est fortement corrélée avec les réponses à la toux induites par les agents tussigènes.

D'autres expériences ont montré que l'inhibition de la sortie synaptique du SP5C ou la suppression de son activité par des méthodes chimiogénétiques éliminaient efficacement ces réflexes de toux. Inversement, la stimulation optogénétique des neurones excitateurs du SP5C ou de leurs projections vers le groupe respiratoire ventral (VRG) a déclenché des comportements robustes semblables à la toux, même en l'absence de stimuli tussigènes.

Notamment, l'augmentation soutenue de l'excitabilité des neurones SP5C a entraîné une toux spontanée chronique chez les souris. Ces résultats apportent des preuves solides de l'existence d'un circuit du tronc cérébral non identifié auparavant (SP5C→VRG) qui contrôle les comportements de défense contre la toux chez les souris.

Objectifs de la recherche

Cette étude a systématiquement identifié et validé le circuit neuronal central contrôlant le comportement de toux en utilisant un modèle de souris et diverses technologies d'analyse des circuits neuronaux, en se concentrant particulièrement sur le rôle du SP5C.

Matériels et méthodes

Une approche multidisciplinaire a été employée pour analyser le comportement de la toux du point de vue du comportement, de l'activité neuronale, de la connectivité des circuits et de la modulation fonctionnelle.

3.1 Modèles animaux
Des souris de type sauvage (WT), transgéniques TRAP2, knock-out conditionnel de la neurexine 1/2/3 (Nrxn123 cTKO), transgéniques VGluT2-IRES-Cre et GAD2-IRES-Cre ont été utilisées pour les manipulations spécifiques au type de cellule.

3.2 Induction et surveillance de la toux
Stimulants de la toux : de l'acide citrique (CA), de la capsaïcine et de l'ammoniac (NH₃) ont été nébulisés pour induire des réactions semblables à la toux.
Système de surveillance : La pléthysmographie du corps entier a enregistré les variations du débit d'air respiratoire, tandis que des microphones et des caméras ont capté les bruits et les mouvements de la toux pour une analyse quantitative multimodale.
Définition de la toux : Un événement semblable à la toux a été défini par le schéma triphasique caractéristique "inspiration-compression-expiration" du flux d'air dans la PBW, accompagné de bruits de toux distincts.

3.3 Surveillance de l'activité neuronale
Photométrie des fibres in vivo : L'AAV-GCaMP6s a été injecté dans des régions cérébrales cibles (par exemple, SP5C, NTS, VRG) pour surveiller les signaux calciques et évaluer les corrélations temporelles avec le comportement de la toux.

3.4 Validation de la nécessité
Blocage de la sortie synaptique : AAV-Cre a été injecté dans le SP5C de souris Nrxn123 cTKO pour bloquer conditionnellement la transmission synaptique.
Inhibition chimiogénétique : L'AAV-hM4Di-mCherry a été injecté dans le SP5C et de la deschloroclozapine (DCZ) a été administrée par voie intrapéritonéale pour inhiber l'activité neuronale.

3.5 Validation de la suffisance
Activation optogénétique : L'AAV-ChrimsonR a été injecté dans le SP5C pour stimuler les neurones excitateurs (CaMKII+). L'activation spécifique de la projection a été réalisée en injectant l'AAV-Cre dans le SP5C et l'AAV-DIO-ChrimsonR dans le VRG.

3.6 Traçage des circuits
Traçage trans-synaptique antérograde et rétrograde :
Antérograde : L'AAV-hSyn-EGFP a été injecté dans le SP5C pour visualiser les projections axonales.
Rétrograde : Le virus Pseudorabies (RV) a été injecté dans le VRG pour marquer les neurones d'entrée monosynaptiques du SP5C.
Stratégie à deux virus : AAV2/1-Cre (antérograde) et AAV2/9-DIO-Chrimson-mCherry ont été utilisés pour confirmer les connexions synaptiques directes entre le SP5C et le VRG.

3.7 Modèle de toux chronique
NaChBac, un canal sodique bactérien voltage-gated, a été surexprimé dans le SP5C pour augmenter l'excitabilité neuronale et induire une toux spontanée.

3.8 Enregistrements électrophysiologiques
Des enregistrements de patch-clamp à cellules entières ont été réalisés sur des tranches de tronc cérébral aiguës afin d'examiner les propriétés neuronales du SP5C (par exemple, potentiel d'action, résistance membranaire).

Résultats

4.1 Établissement et validation du modèle de comportement de la toux
Le NH₃, le CA et la capsaïcine ont induit des réponses typiques de la toux, caractérisées par un flux d'air triphasique et des bruits de toux distincts. Le NH₃ a été choisi comme principal stimulus de toux en raison de ses effets puissants et constants.

Les traitements de contrôle (solution saline) ont produit une toux négligeable, confirmant la spécificité du modèle.

4.2 L'activité neuronale du SP5C est fortement corrélée à la toux
Le marquage TRAP2 a montré que la stimulation NH₃ activait les neurones du SP5C, du NTS et du VRG. La photométrie à fibres a confirmé que les signaux calciques du SP5C augmentaient de façon significative pendant les épisodes de toux et étaient synchronisés avec le moment de la toux.

4.3 Le SP5C est nécessaire au réflexe de toux
Le blocage de la sortie synaptique dans le SP5C des souris Nrxn123 cTKO a significativement réduit la toux induite par le NH₃. L'inhibition chimiogénétique des neurones SP5C a fortement supprimé les réponses à la toux, alors que les témoins n'ont pas été affectés.

4.4 L'activation du SP5C déclenche directement la toux
L'activation optogénétique des neurones VGluT2+ ou GAD2+ a seulement modifié le rythme respiratoire sans induire de toux. En revanche, la stimulation des neurones excitateurs CaMKII+ dans le SP5C a déclenché des comportements robustes de type toux sans stimuli tussigènes.

4.5 Le SP5C régule la toux par des projections directes vers le VRG
Les expériences de traçage ont révélé des projections directes du SP5C vers le cVRG, le rVRG et le preBötC. Le traçage viral rétrograde a confirmé l'existence de connexions monosynaptiques entre le SP5C et le VRG. L'activation optogénétique des projections SP5C→VRG a induit une toux, la stimulation à haute fréquence étant plus efficace.

4.6 L'excitabilité accrue du SP5C induit une toux chronique spontanée
La surexpression de NaChBac dans le SP5C a entraîné une toux spontanée dans les 3 à 4 jours, la fréquence augmentant avec le temps. Ces souris ont également montré une sensibilité accrue au NH₃, avec des réponses plus fortes et plus rapides à la toux. Des enregistrements électrophysiologiques ont confirmé une excitabilité accrue et des potentiels d'action spontanés dans les neurones SP5C.

Conclusion

Cette étude a permis d'identifier et de valider systématiquement le circuit neuronal central contrôlant le comportement de toux chez la souris, en mettant en évidence le rôle critique du SP5C.

Les principaux résultats sont les suivants :
- **Le SP5C est un noyau central clé pour le réflexe de la toux** : Son activité neuronale est synchronisée avec la toux, son inhibition élimine la toux et son activation la déclenche.
- **Le SP5C régule directement le VRG par l'intermédiaire de connexions monosynaptiques** : Cette voie constitue la base neuronale de la production motrice de la toux.
- **L'hyperexcitabilité du SP5C provoque une toux chronique** : L'augmentation de l'excitabilité neuronale du SP5C induit une toux spontanée et une hypersensibilité à la toux, ce qui permet de mieux comprendre les mécanismes de la toux chronique.
- **Les souris sont un modèle valable pour l'étude des mécanismes neuronaux de la toux** : Les technologies multimodales ont confirmé la fiabilité du comportement de la souris semblable à la toux, ce qui conforte l'utilisation des souris dans la recherche sur les circuits neuronaux.

**Importance et perspectives
Cette étude révèle l'existence d'un centre de régulation de la toux (SP5C) jusqu'alors négligé et offre de nouvelles perspectives mécanistiques sur la toux chronique et l'hypersensibilité à la toux. Elle pourrait ouvrir la voie au développement de thérapies antitussives ciblées au niveau central.

【Reference】

Xu X, Nie X, Zhang W, et al. Un circuit du tronc cérébral contrôle les comportements défensifs des voies aériennes semblables à la toux chez les souris. *bioRxiv*, 2024 : 2024.09.08.611924.