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Extraction et purification des acides nucléiques
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Extraction et purification des acides nucléiques
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1. Introduction à l'extraction et à la purification des acides nucléiques
L'extraction de l'acide nucléique est une partie fondamentale de la biologie moléculaire, car un acide nucléique de haute qualité est essentiel pour les applications de biologie moléculaire.
Nous résumerons certaines des techniques d'extraction d'acide nucléique actuellement utilisées et des conseils pour choisir la méthode d'extraction correcte pour le type d'échantillon ; nous mentionnerons également l'évaluation de la concentration et de la qualité de l'acide nucléique, ainsi que les problèmes courants dans le processus d'extraction de l'acide nucléique.
a. Pourquoi l'extraction des acides nucléiques est-elle nécessaire ?
L'extraction de l'acide nucléique apporte des réponses à un grand nombre de recherches et d'applications étendues (par exemple : clonage, qRT-PCR et technologie de séquençage de nouvelle génération dans le domaine du génome entier et du transcriptome), et l'acide nucléique obtenu peut être utilisé de diverses manières.
L'objectif exact de la recherche détermine le type d'acide nucléique à extraire ; l'application de l'acide nucléique affecte souvent le choix de la méthode d'extraction. (Par exemple : une réaction standard de PCR en point final n'exige pas la même qualité d'ADN qu'une expérience de séquençage du génome entier)
Afin de déterminer la méthode de recherche, il est nécessaire de bien comprendre les applications en aval des acides nucléiques et les éventuelles limitations liées au type d'échantillon. (Par exemple, la collecte d'échantillons cliniques est souvent limitée, et l'extraction des acides nucléiques présente des difficultés)
Bien que la méthode de lyse cellulaire soit différente selon le type d'échantillon, le principe de base de l'extraction globale des acides nucléiques reste le même : les échantillons de cellules ou de tissus sont lysés pour éliminer les contaminants autres que les acides nucléiques (par exemple, les protéines, etc.).
Raisons de l'extraction de l'acide nucléique :
①Pour analyser l'expression des gènes en recherche fondamentale et en recherche sur les maladies ;
②Suivre la réponse à un traitement médicamenteux (par exemple, surveiller le titre du virus pendant et après un traitement antiviral).
③Identifier de nouvelles espèces et mieux comprendre le processus d'évolution (par exemple, analyse de l'ADN ancien).
④Surveiller et classer les agents pathogènes à l'origine des épidémies de maladies infectieuses chez l'homme, les animaux et les plantes.
⑤Surveiller la sécurité des aliments et de l'eau par des tests microbiologiques et une surveillance quantitative.
⑥Diagnostiquer les maladies (telles que les maladies génétiques, le cancer, les défauts immunologiques).
b. Méthode de lyse cellulaire
La lyse cellulaire dépend largement du type d'échantillon, et les tissus plus résistants, comme les plantes, nécessitent plus de force pour être traités que les mammifères.
Les méthodes de lyse cellulaire sont divisées en trois catégories : lyse mécanique, lyse enzymatique et lyse chimique.
Les principes de base des trois méthodes d'analyse ainsi que les avantages et les inconvénients de chaque méthode sont les suivants :
Méthode 1 : Lysse mécanique
Lysis mécanique : La membrane cellulaire est détruite par une force externe.
Avantage :
Efficacité élevée et vitesse rapide ;
La lyse rapide raccourcit le temps entre le prélèvement de l'échantillon et l'isolement de l'acide nucléique, ce qui peut être crucial dans les expériences d'analyse de l'expression des gènes ;
Idéal pour les échantillons difficiles à dissoudre (par exemple, matériel végétal, champignons filamenteux et levure).
Inconvénients :
Selon la méthode utilisée, le traitement d'un grand nombre d'échantillons prend du temps (par exemple, le traitement par broyage manuel) ;
Le traitement d'un grand nombre d'échantillons prend du temps et peut augmenter le risque de dégradation de l'échantillon ;
Le traitement mécanique génère de la chaleur dans l'échantillon, ce qui entraîne l'agrégation des protéines et la dégradation des acides nucléiques ; l nécessite certains outils ou équipements spéciaux.
Méthode 2 : Lyse enzymatique
Ajouter une enzyme pour digérer les protéines ou les structures cellulaires, comme les parois cellulaires des levures et les champignons filamenteux.
Avantage :
La méthode idéale en laboratoire, sans équipement de craquage mécanique dans le processus ;
Enlève sélectivement la paroi cellulaire, laissant la partie cellulaire pour utiliser une autre méthode de lyse (généralement la lyse chimique), la méthode est flexible, et certains dommages causés par la lyse mécanique sont évités.
Inconvénients :
Prend du temps (la digestion enzymatique peut prendre 1 heure) et est coûteuse ;
Comme les modifications cellulaires induites par l'enzyme peuvent affecter l'expression des gènes, elle ne convient pas à l'analyse de l'expression des gènes.
Méthode 3 : Lyse chimique
Dans le processus de décomposition chimique, les cellules sont lavées avec un détergent qui peut décomposer les membranes lipidiques, libérant ainsi les composants cellulaires. Outre les détergents, les tampons de lyse chimique contiennent généralement des sels chaotropes, tels que le chlorhydrate de guanidine ou l'urée, qui contribuent à dégrader la stabilité des protéines d'acide nucléique nouvellement exposées (telles que les nucléases) et à lier les acides nucléiques à la matrice de silice. La composition exacte du tampon de lyse chimique dépend de la direction de l'application et du type d'échantillon.
Avantage :
Le prix est bon marché, l'opération est simple, et la vitesse est rapide ; aucun équipement spécial n'est nécessaire.
Inconvénients :
Les détergents qui détruisent les membranes cellulaires dissolvent généralement aussi d'autres membranes cellulaires, libérant ainsi leurs composants. Cette méthode n'est pas adaptée à l'extraction d'acides nucléiques spécifiques des organites ;
Bien que cette technologie soit efficace contre E. coli, elle ne l'est pas contre les bactéries à Gram positif, les cellules végétales ou les cellules fongiques en raison de la paroi cellulaire dure qui empêche le détergent de pénétrer dans la membrane cellulaire ;
L'ajout simultané de détergent et de sel chaotropique aux échantillons d'E. coli peut affecter la capacité de distinction de l'ADN plasmidique et de l'ADN génomique. Toutefois, il est possible de prendre des mesures pour distinguer ces types, qui seront abordées plus loin.
Les substances chimiques peuvent être dangereuses pour les chercheurs.
c. Compréhension des principes de la purification des acides nucléiques
Après la lyse de la cellule, l'acide nucléique est sélectivement libéré des composants cellulaires environnants et concentré dans une solution aqueuse ou une solution tampon appropriée pour une utilisation ultérieure. Les étapes qui suivent la compréhension de la cellule sont collectivement appelées purification. Comme les propriétés chimiques de l'acide nucléique isolé restent inchangées, quel que soit le type d'échantillon, la stratégie de purification décrite ci-dessous est généralement applicable à tous les types d'échantillons.
① Colonnes à centrifuger
Cette méthode est généralement étroitement liée au kit. L'extraction et la purification par colonne à centrifuger permettent d'obtenir rapidement de l'ADN, des plasmides, de l'ARN et des produits PCR de haute qualité sans avoir à préparer de nouveaux réactifs. La colonne de spin contient une matrice solide de gel de silice ou de résine propriétaire pour la fixation sélective des acides nucléiques.
Étapes typiques d'une opération d'extraction sur colonne de spin :
A. Maintenir l'échantillon lysé sur la colonne de spin :
L'échantillon lysé est recueilli dans un tampon de liaison contenant des sels chaotropiques et placé sur une colonne de spin. Le tampon de liaison permet à l'acide nucléique d'être séparé de la solution aqueuse et de se lier à la matrice de la colonne.
B. Fixation de l'acide nucléique :
La centrifugation met l'ensemble de l'échantillon en contact avec la matrice de la colonne. Les acides nucléiques de l'échantillon se lient sélectivement à la colonne, tandis que les autres composants cellulaires traversent la matrice de la colonne (c'est ce qu'on appelle communément le flux).
C. Lavage :
Après la liaison, la colonne est nettoyée pour éliminer les contaminants résiduels, tels que les protéines ou les sels résiduels, qui peuvent affecter sérieusement les applications en aval. Le nombre de lavages dépend du kit. Certains tampons de lavage contiennent des sels chaotropiques pour éliminer les protéines, et certains tampons contiennent de fortes concentrations d'éthanol pour éliminer les sels. La plupart des kits incluent presque entièrement un tampon composé d'éthanol comme étape de lavage pour assurer une désalinisation complète.
D. Élimination de l'éthanol résiduel de la colonne de filtrage :
Après le lavage, on effectue parfois une courte période de centrifugation à vide pour éliminer l'éthanol résiduel.
E. Elution :
Pour éluer les acides nucléiques de la matrice, ajouter une petite quantité d'eau ou de tampon d'élution*, et laisser la colonne reposer pendant quelques minutes. Depuis l'étape précédente, le sel chaotropique a été éliminé, et le tampon d'élution peut réhydrater l'acide nucléique et séparer l'acide nucléique de la matrice de la colonne. Une centrifugation permet de transférer la solution aqueuse contenant l'échantillon d'acide nucléique dans un nouveau tube de centrifugation.
*Les acides nucléiques sont généralement conservés dans un tampon contenant du Tris et de l'EDTA (tampon TE). La présence d'EDTA permet d'inhiber l'activité des nucléases. Bien que le tampon TE soit efficace pour inhiber les nucléases, la teneur en EDTA dans le TE est généralement inférieure de plusieurs ordres de grandeur à la teneur en Mg2+.
Avantages et inconvénients des colonnes de spin :
Avantage :
faible coût
Efficace et fiable
Produisent des acides nucléiques adaptés aux applications en aval
Inconvénients :
Les souches à croissance lente ont de faibles niveaux d'acide nucléique
Une élution incomplète entraîne une perte d'acide nucléique
La capacité de liaison de la colonne de spin détermine la quantité totale d'acide nucléique
Kit de colonne d'extraction de plasmides
Les kits d'extraction de plasmides permettent d'isoler rapidement les plasmides d'E. coli et sont l'un des kits les plus utilisés dans les laboratoires de biologie moléculaire.
E. coli étant facile à lyser chimiquement, le kit plasmide combine la lyse de l'échantillon et la purification des acides nucléiques comme suit :
A. Les cellules bactériennes sont lysées dans un tube à centrifuger avant que les débris cellulaires ne soient centrifugés et précipités ;
B. La configuration du tampon de lyse est telle que seul l'ADN plasmidique peut être combiné avec la colonne de spin après la lyse. Par conséquent, le lysat cellulaire peut être immédiatement monté sur la colonne par centrifugation.
C. Combinez le plasmide contenant le lysat avec la colonne de spin, et les étapes de purification restantes sont similaires à tous les autres schémas de colonne de spin.
D. Utilisez de l'ADN plasmidique de haute qualité pour l'élution dans l'eau ou le tampon TE.
**La plupart des kits de colonne à centrifuger distinguent l'ADN plasmidique de l'ADN génomique (ADNg) pendant le processus de lyse. Le tampon de lyse contient de l'hydroxyde de sodium et du lauryl sulfate de sodium pour dénaturer complètement le plasmide et l'ADNg. À l'étape suivante, l'échantillon est neutralisé et l'ADN plasmidique renaît. Cependant, l'ADNg de poids moléculaire élevé ne peut pas être complètement recombiné et s'emmêle facilement avec les protéines de l'échantillon, empêchant ainsi l'ADNg de se lier à la colonne de spin, ce qui conduit à son élimination. Bien qu'en termes d'efficacité et de fiabilité, les kits de colonne à centrifuger pour plasmides présentent certaines lacunes. La norme d'optimisation du kit passe principalement par les souches d'Escherichia coli, les souches lentes ou instables peuvent avoir de faibles rendements. En outre, les kits de plasmide et les kits de colonne d'essorage ont une capacité de liaison limitée. Selon le kit, le taux de récupération total se situe entre 50 et 100 μg.
Autres kits de colonne à centrifuger
Outre l'extraction des acides nucléiques, les colonnes de spin sont également utilisées pour la purification et la concentration des acides nucléiques. Les kits de purification peuvent être utilisés pour éliminer les réactifs résiduels n'ayant pas réagi dans les réactions de PCR ou d'autres préparations enzymatiques, et pour purifier l'ADN des gels d'agarose. Les échantillons concentrés peuvent offrir une plus grande flexibilité pour de nombreuses applications en aval.
Certains kits commerciaux de colonnes de spin ont la fonction de criblage de fragments, permettant de sélectionner des kits de gamme de fragments appropriés (par exemple, petit ARN) en fonction de l'objectif de la recherche. Cette fonction est obtenue en modifiant la teneur en éthanol de la solution tampon.
De nombreux kits de colonnes à centrifuger combinent la lyse cellulaire et la purification des acides nucléiques. On peut trouver des colonnes de spin pour la séparation des acides nucléiques à partir de presque tous les types d'échantillons, y compris, mais sans s'y limiter, les insectes, les plantes, les graines, les champignons, les bactéries, la salive, le sang, les matières fécales et les échantillons emboîtés en paraffine.
② Précipitation au phénol/chloroforme et à l'éthanol
La méthode d'extraction phénol/chloroforme est une méthode qui repose sur le principe de la différence de solubilité pour séparer les acides nucléiques. L'échantillon est exposé à un rapport donné de mélange phénol/chloroforme pour obtenir l'acide nucléique recherché. Les protéines sont solubles dans le mélange phénol/chloroforme, l'acide nucléique est soluble dans l'eau. Lorsque la solution phénol/chloroforme est mélangée à l'échantillon, la protéine et l'acide nucléique sont séparés, ce qui garantit la purification.
Pour la double extraction de l'ARN et de l'ADN, ce processus peut être ajusté en ajoutant du phénol acide. Cela permet aux ions H+ en excès d'interagir avec le squelette phosphate, ce qui donne un ADN non chargé. L'ADN sera dissous dans la couche de phénol extraite par le phénol/chloroforme, tandis que l'ARN restera dissous dans la phase aqueuse en raison de son acidité naturelle. Après centrifugation, les phases aqueuse et organique peuvent être séparées, et chaque phase peut être précipitée à l'éthanol.
Étapes opérationnelles de la précipitation classique au phénol/chloroforme et à l'éthanol :
A. Mise en contact du phénol et du chloroforme :
L'échantillon lysé est généralement mélangé au phénol/chloroforme par un fort vortex. Le vortex garantit que tous les composants organiques peuvent interagir pleinement avec le mélange phénol/chloroforme pour obtenir une dissolution et une élimination complètes.
B. Centrifugation : Après l'étape A, deux phases sont visibles. La phase aqueuse contenant les acides nucléiques est en haut, tandis que la phase organique en bas contient des protéines, des lipides et d'autres macromolécules. Il faut ensuite centrifuger l'échantillon pour séparer complètement les deux phases
C. Séparation des phases : retirez soigneusement la phase aqueuse à l'aide d'une pipette.
D. Précipitation à l'éthanol : précipitation et purification de l'acide nucléique avec de l'éthanol. Pendant le processus de précipitation à l'éthanol, du sel et de l'éthanol sont ajoutés pour tamponner l'acide nucléique dans la solution aqueuse. Le sel tamponne le squelette phosphate du sucre, et l'éthanol modifie la constante diélectrique de la solution. Cela permet de séparer l'acide nucléique de la solution aqueuse, qui peut être séparée par centrifugation à grande vitesse.
E. Resuspension : Redissoudre l'ADN ou l'ARN dans un amas dans de l'eau ou un tampon TE.
Avantages et inconvénients de l'extraction phénol/chloroforme :
Avantage :
Rendement élevé, généralement supérieur au rendement de la colonne de spin ; ü Convient à l'extraction d'ADN complet de poids moléculaire élevé (par exemple, l'ADNg) ;
Les échantillons en suspension dans des solutions complexes sont généralement encore adaptés à cette méthode, et certains composés volatils peuvent interférer avec la matrice de la colonne à centrifuger ;
Pour les échantillons de graisse (par exemple, le tissu cérébral), l'extraction phénol/chloroforme est meilleure que la plupart des kits de colonne de spin.
Inconvénients :
S'ils ne sont pas manipulés correctement, le phénol et le chloroforme sont nocifs et doivent être manipulés avec une extrême précaution sous une hotte.
Cette méthode prend plus de temps que les kits de colonne rotative et peut donner des rendements inférieurs.
Les traces de phénol et de chloroforme dans l'extrait d'acide nucléique auront un impact négatif sur les réactions enzymatiques en aval, comme la PCR. Si c'est le cas, il faut le purifier avant la PCR. Il existe donc de nombreux kits de purification sur colonne de spin.
Un peu d'expérience pratique peut être nécessaire pour extraire en toute sécurité la phase aqueuse exempte de contaminants.
③Méthodes automatiques pour augmenter le rendement
Selon les différentes applications d'acides nucléiques et les types d'échantillons, des méthodes d'extraction à haut débit adaptées peuvent être sélectionnées. La plus couramment utilisée est l'extraction par billes magnétiques. Dans cette technique, des billes magnétiques chargées positivement sont introduites dans l'échantillon, et l'ADN est combiné avec les billes magnétiques chargées positivement à un pH faible, et l'ADN est libéré à un pH élevé. Les billes peuvent être retirées par un aimant, et le pH de la solution peut être facilement ajusté pour séparer l'acide nucléique souhaité. Cette technologie est rapide et efficace, mais l'investissement dans l'équipement d'automatisation peut être assez coûteux. (Le matériau de revêtement des billes magnétiques est différent, et le principe est légèrement différent)
d. Les facteurs clés et leur impact sur l'extraction
Lorsque vous effectuez une extraction ou une purification d'acide nucléique, vous devez prêter une attention particulière à certains facteurs, tels que le pH, la concentration en sel, la température, le volume du tampon et la contamination potentielle par l'éthanol. Chacun de ces facteurs affectera grandement le rendement, la qualité et le taux de réussite des expériences en aval.
1. Un pH ou une concentration en sel non optimaux peuvent modifier la charge de l'acide nucléique, ce qui peut empêcher l'acide nucléique de se lier à la colonne de spin, ou entraîner la dissolution de l'acide nucléique par erreur dans le phénol/chloroforme.
2. Un volume de tampon incorrect peut entraîner une lyse incomplète, une neutralisation ou une dilution indirecte de l'acide nucléique élué.
3. Une contamination par l'éthanol peut inhiber les réactions enzymatiques en aval et faire flotter l'échantillon hors du gel d'agarose.
e. Circonstances particulières
1. Extraction d'ADN de poids moléculaire élevé
Pour certaines applications (telles que l'hybridation de Southern et certains processus de séquençage), il est nécessaire d'extraire l'ADN de poids moléculaire élevé (HMW) intact. Pour extraire l'ADN HMW, outre les facteurs ci-dessus, d'autres facteurs doivent être pris en compte :
L'ADN HMW est facilement cassé pendant le processus d'extraction. En effet, les forces de cisaillement (vortex, ultrasons, etc.) peuvent provoquer la décomposition des molécules d'ADN, ce qui donne des fragments plus courts après l'extraction. Pour éviter cela, appliquez un cisaillement minimal à l'échantillon.
Pour les applications qui nécessitent la visualisation de l'ADN HMWD, la lyse et l'extraction peuvent être effectuées dans un bouchon de gel d'agarose pour stabiliser l'ADN pendant tout le processus (par exemple, électrophorèse sur gel à champ pulsé), où le chromosome entier reste intact et visualisé par électrophorèse.
La lyse alcaline entraîne souvent la perte d'ADN HMW, car l'ADN HMW s'enchevêtre de manière irréversible pendant le processus de dénaturation.
Si vous utilisez une colonne de spin pour extraire l'ADN HMW, tenez compte de la capacité de liaison de la matrice de la colonne. Certaines colonnes ne peuvent traiter que des fragments d'une taille de 10 à 15 kb, car les fragments plus grands sont difficiles à éluer de la colonne en raison d'une liaison étroite. Pour les fragments plus grands, il peut être nécessaire d'envisager des colonnes dédiées avec une forte liaison HMW, ou des méthodes manuelles telles que l'extraction phénol/chloroforme et la précipitation à l'éthanol.
2.SmallRNAs
Dans le processus traditionnel d'extraction de l'ARN, les petites molécules d'ARN sont souvent perdues, car les colonnes de spin traditionnelles ont généralement une taille limite d'environ 100 paires de bases, bien que la taille limite dépende largement de la formulation du tampon. Les petites molécules d'ARN sont extrêmement importantes pour comprendre les fonctions biologiques, c'est pourquoi la plupart des kits d'extraction et de purification de l'ARN total sont optimisés pour capturer ces petits ARN.
2. Évaluez l'acide nucléique extrait
a. Quantification et contrôle de qualité
Après l'extraction et la purification de l'acide nucléique, il est très important de connaître la concentration et la qualité de l'échantillon extrait. Selon le but de l'expérience en aval, les fluctuations de ces paramètres peuvent grandement modifier les résultats. Par exemple, si chaque réaction de synthèse d'ADNc n'utilise pas exactement le même ARN total, l'analyse d'expression par qRT-PCR donnera des données peu fiables. Il existe de nombreuses méthodes d'évaluation des acides nucléiques, qui diffèrent en termes de temps, de coût et de précision. Enfin, les exigences des expériences en aval doivent être prises en compte lors du choix des méthodes.
Voici un aperçu de certaines des méthodes d'évaluation les plus courantes :
1. l'électrophorèse en gel d'agarose
L'électrophorèse en gel d'agarose est basée sur le poids moléculaire et sépare les acides nucléiques à travers une matrice de gel solidifié en présence d'un courant électrique. L'acide nucléique extrait est comparé à un standard de poids moléculaire parallèle, qui contient des fragments de taille et de concentration connues.
Avantages : contrôle visuel de la qualité de l'ADN ; les échantillons d'ADN génomique complets sont représentés par des bandes complètes ; les acides nucléiques dégradés sont représentés par des bandes diffuses ; l'ARN ribosomal est clairement visible ; disponible pour la plupart des laboratoires ; visualisation d'une éventuelle contamination (par exemple, échantillons de purification de plasmides dans lesquels l'ARN est présent).
Inconvénients : Seule une estimation approximative de la concentration est fournie ; il ne montre pas la présence de contaminants, tels que le sel, dans l'échantillon.
2. Électrophorèse capillaire
L'électrophorèse capillaire, parfois appelée "laboratoire sur puce", fait passer des échantillons dans un petit capillaire surveillé par un détecteur. L'ordinateur reçoit les informations et les affiche sous forme de graphique. L'électrophorèse capillaire permet d'analyser la taille des fragments, la quantité et la qualité générale de l'échantillon. Cette technique est plus précise que l'électrophorèse traditionnelle à l'agarose, et constitue généralement une méthode d'évaluation des acides nucléiques avant la qPCR.
Avantages : analyse précise de plusieurs types d'acides nucléiques ; le chargement et la quantification automatiques de l'échantillon sont plus précis que la méthode du gel ; sensibilité élevée : les échantillons de petite taille et de petite taille peuvent être détectés et analysés.
Inconvénients : coûteux.
3. Spectrophotométrie
La spectrophotométrie est une technique de détection rapide qui repose sur les caractéristiques de la lumière interagissant avec l'échantillon pour une quantification précise. L'échantillon est chargé dans l'instrument de test (spectrophotomètre), traversé par différentes longueurs d'onde de lumière, puis reçu par le détecteur. Le détecteur fournit des informations sur la quantité et la qualité de l'échantillon, qui sont ensuite traduites par le logiciel informatique. En mesurant l'absorbance à 260nm et 280nm, le rapport des deux indique la pureté de l'échantillon. Pour un ADN et un ARN purs, le rapport 260/280 doit être compris entre 1,8 et 2,1. Des mesures supplémentaires peuvent être effectuées à 230nm, et un rapport 230/280nm inférieur à 2,0 indique la présence de contaminants organiques.
Ces dernières années, un nouveau type de méthode d'analyse spectrophotométrique basée sur la fluorescence a été largement utilisé dans les laboratoires de biologie moléculaire. Cette technologie basée sur la fluorescence a une sensibilité plus élevée que la spectrophotométrie traditionnelle, et peut distinguer l'ADN et l'ARN en utilisant des colorants fluorescents uniques à l'ADN et à l'ARN.
Avantages : précis et rapide ; fournit des informations sur la présence de contaminants ; la plupart des laboratoires disposent de spectrophotomètres.
Inconvénients : Impossible de quantifier un seul segment ; coûteux.
b. Améliorer la qualité de l'acide nucléique
Malgré nos grands efforts, il est généralement nécessaire de prendre des mesures supplémentaires pour améliorer la qualité des acides nucléiques. Les paragraphes suivants décrivent quelques facteurs supplémentaires qui doivent être pris en compte pour améliorer la qualité des acides nucléiques.
1. Température d'utilisation et de stockage :
Les acides nucléiques sont facilement dégradés par les nucléases (à savoir la RNase et la DNase), et un stockage à basse température peut contribuer à inhiber l'activité enzymatique. L'ADN est intrinsèquement plus stable que l'ARN et résiste mieux à l'activité des nucléases à des températures de stockage plus élevées.
L'ADN doit être stocké à -20°C ou moins, et conservé sur de la glace pendant son utilisation. La congélation et la décongélation répétées peuvent fragmenter l'ADN, en particulier l'ADN HMW. Par conséquent, si l'ADN HMW est utilisé fréquemment, il doit être conservé à 4°C.
L'ARN est plus facilement dégradé par les nucléases et doit toujours être conservé à une température très basse (-20 à -80°C), et décongelé uniquement si nécessaire.
2. Inhibiteur de nucléases et solution de nettoyage
La présence de nucléases peut rapidement dégrader les échantillons d'acides nucléiques. Il est facile de transférer des nucléases des mains non protégées à la surface de travail ; par conséquent, vous devez toujours porter des gants lorsque vous travaillez avec des acides nucléiques.
Le lieu de travail doit être maintenu propre et fréquemment essuyé avec de l'éthanol pour éliminer la contamination par les nucléases. Il existe de nombreux produits commerciaux qui peuvent prévenir la contamination par la RNase. De nombreux chercheurs ont également ajouté l'inhibiteur de ribonucléase pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) à l'eau pour le travail sur l'ARN. Il est également conseillé de laver et de traiter la verrerie avec du DEPC avant de travailler sur l'ARN.
Ces dernières années, de nombreux stabilisateurs d'acides nucléiques sont apparus sur le marché. Contrairement aux solutions de nettoyage décrites ci-dessus, ces réactifs sont ajoutés directement à l'échantillon intact au point de collecte pour inhiber les nucléases et stabiliser les acides nucléiques jusqu'à l'extraction. Bien que la plupart de ces réactifs soient compatibles avec la plupart des kits d'extraction et des applications en aval, certains d'entre eux doivent être retirés des échantillons intacts avant l'extraction des acides nucléiques.
3. Utilisez des consommables exempts de nucléases
Lorsque vous utilisez un acide nucléique, veillez à nucléaser les consommables et la verrerie. Dans la mesure du possible, achetez des tubes sans nucléase et des embouts de pipette avec filtre. Si, après analyse, vous constatez que votre rendement en ADN est faible et que la qualité n'est pas idéale, ou si l'ADN extrait passe avec succès votre évaluation de la qualité mais que vous obtenez des résultats insatisfaisants lors de l'expérience en aval, vous devez procéder à un dépannage .