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#Tendances produits
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Séquencer tout en synthétisant
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le principe de base du NGS
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Le NGS est le processus de fragmentation et d'épissage aléatoires de l'ADN pour préparer une bibliothèque de séquençage. En effectuant des réactions d'extension sur les dizaines de milliers de clones de la bibliothèque, on détecte les signaux correspondants et on obtient finalement des informations sur la séquence.
Le principe de base de la NGS est le séquençage tout en synthétisant, comme l'analyse la suivante.
Cycle 1 : ajout du système de réaction
Incorporation d'une base
Élimination des autres nucléotides non incorporés
Détection du signal
Cycle 2 - n : Ajout du système réactionnel, Répétition du cycle 1
11. Quatre NTP marqués par fluorescence sont ajoutés à chaque cycle de réactions de séquençage.
terminés par un groupe protecteur qui peut être retiré.
2. Un seul nucléotide est intégré dans chaque cycle de réaction et l'instrument lit le signal de fluorescence correspondant.
3. A la fin de la lecture du signal, élimination chimique des groupes bloquants et fluorescents pour le tour suivant de réactions de séquençage.
Actuellement, Illumina est l'une des sociétés les plus utilisées sur le marché. La bibliothèque préparée est fixée sur une puce spéciale "Flowcell" par le principe de l'appariement complémentaire des bases, selon les étapes suivantes :
I. Flowcell 8 voies, surface intérieure → chimiquement modifiée → 2 amorces d'ADN → complémentaires de la séquence d'épissage de la bibliothèque d'ADN à séquencer → liées de manière covalente à la Flowcell pour éviter qu'elle ne soit emportée par le liquide
II. Bibliothèque d'ADN : de nombreux fragments d'ADN, joints aux deux extrémités avec une jonction d'ADN spécifique pour former un mélange d'ADN → deux caractéristiques, méthode de production → ultrasons pour interrompre l'ADN génomique, les deux extrémités avec des enzymes pour remplir, en utilisant l'enzyme de Klenow pour ajouter une base A à l'extrémité 3', puis une ligase pour joindre la jonction → former une bibliothèque → mélange d'ADN
III. PCR pont : ensemencer la bibliothèque sur la puce → hybridation complémentaire (les séquences d'ADN aux deux extrémités de la bibliothèque sont complémentaires des amorces sur la puce) → ajouter des dNTP et des enzymes → générer un nouveau brin → ajouter une solution alcaline de NaOH → brin d'ADN non brinisé → laisser le brin original → ajouter un liquide neutre pour neutraliser la solution alcaline → l'autre extrémité de l'ADN est hybridée de façon complémentaire avec la seconde amorce sur la plaque de verre → ajouter des enzymes et des dNTP → ajouter de l'alcali → ajouter du liquide neutre → répéter le processus pour l'amplification
IV. Transformer la double chaîne synthétisée en une chaîne unique qui peut être séquencée → réaction chimique → couper un groupe spécifique sur une amorce → la solution alcaline lave la chaîne restante de la puce → ajouter une solution neutre avec une amorce de séquençage (avec dNTP marqué par fluorescence → l'extrémité 3' est bloquée par un groupe azide → un cycle ne peut étendre qu'une base, la polymérase → sélectionner le dNTP complémentaire de la base dans la position d'origine) → éliminer l'excès de dNTP et d'enzymes par l'eau → placer la base sur le microscope pour le balayage laser → déterminer le type de base (4 dNTP) en fonction de la fluorescence émise → ajouter des réactifs chimiques pour couper le groupe azide et le groupe fluorescent étiqueté à côté → exposer le groupe hydroxyle à l'extrémité 3' → ajouter de nouveaux dNTP et de nouvelles enzymes → étendre une base à nouveau → rincer l'excès d'enzymes et de dNTP → lire la couleur dans le scan laser → répéter le processus
V. Index : Marquage sur la jonction de la bibliothèque ; la séquence spécifique sur la jonction spécifique à l'échantillon marque l'origine de l'échantillon
VI. Index de lecture : alcaliniser l'ADN non brin read1 → ajouter une solution neutre → ajouter l'amorce de séquençage read2 (site de liaison à côté de la séquence d'index) → effectuer 2 tours de séquençage (généralement 6 à 8 bases) → comprendre un segment spécifique d'ADN à partir duquel l'échantillon de l'origine
VII. Séquençage double-face : un brin d'ADN est lu une fois dans les deux sens, avant et arrière, ce qui double la longueur effective du séquençage
VIII. Brin inversé : synthétiser le brin complémentaire d'ADN → couper la racine du brin original avec des réactifs chimiques → brin complémentaire restant → effectuer un second séquençage (ajouter des amorces read3 pour lire les bases)