Quelles sont les techniques de biopsie liquide ? by SPACEGENMedicalExpo

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La biopsie liquide fait référence à l'analyse et au diagnostic du cancer et d'autres maladies en testant le sang ou d'autres fluides corporels tels que l'urine, la salive, l'épanchement pleural, le liquide céphalorachidien, etc. Le liquide corporel du patient est principalement utilisé comme échantillon de biopsie de la tumeur, et les objets capturés et détectés comprennent les cellules tumorales circulantes (CTC), l'ADN tumoral circulant (ctDNA) et les exosomes dans les liquides corporels. La biopsie liquide est l'un des domaines les plus en vogue dans l'industrie biomédicale ces dernières années. Par rapport à la biopsie tissulaire standard, la biopsie liquide présente certains avantages théoriques : moins de traumatismes, reproductibilité, jugement en temps réel de l'efficacité, ajustement dynamique des décisions de traitement, etc.

L'émergence de la technologie de la biopsie liquide marque un autre grand pas en avant pour l'humanité sur la voie de la conquête du cancer. Par rapport à la biopsie tissulaire traditionnelle, la biopsie liquide présente plusieurs avantages : Premièrement, la biopsie liquide peut se substituer aux zones que la biopsie tissulaire ne peut atteindre. Deuxièmement, les biopsies tissulaires ne peuvent refléter que les informations contenues dans l'échantillon, tandis que les biopsies liquides peuvent détecter l'état général du patient. En outre, les biopsies liquides détectent principalement l'ADN tumoral circulant (ADNc), qui passe généralement du tissu tumoral aux vaisseaux sanguins. Par conséquent, les biopsies liquides permettent de localiser les cellules cancéreuses plus rapidement que si le diagnostic reposait sur les symptômes et les images. La technologie de la biopsie liquide est rentable. Grâce à un échantillonnage non invasif, elle peut non seulement réduire considérablement la difficulté du diagnostic et des soins du cancer, mais aussi avancer le moment du diagnostic du cancer et prolonger efficacement la période de survie des patients.

1）Les cellules tumorales circulantes (CTC) sont définies comme les cellules cancéreuses qui quittent les lésions tumorales solides et entrent dans la circulation sanguine. Les CTC ne sont pas les seuls dérivés tumoraux présents dans la circulation, mais ils contiennent un ensemble de précurseurs métastatiques essentiels à la progression complète de la maladie. Les cellules tumorales circulantes qui entrent dans la circulation sanguine contiennent un génome complet, un protéome et d'autres informations biologiques, et ont le potentiel de se développer en lésions métastatiques, représentant l'agressivité des tumeurs.

Cependant, les conditions techniques limitent l'isolement des CTCs vivants, principalement en raison de la difficulté d'isoler les CTCs dans leur état de rareté par rapport aux cellules sanguines. Mais les technologies nouvellement développées ne manquent pas, qui permettent à la fois de capturer et d'isoler les CTC et de les tester au niveau moléculaire pour déterminer si elles conviennent à des applications cliniques. Sur le plan clinique, les CTC ont démontré leur valeur en tant que biomarqueurs prédictifs du pronostic d'une maladie, et leur aptitude à d'autres applications est actuellement testée. Techniquement, il est généralement nécessaire d'enrichir les cellules tumorales circulantes à partir des cellules sanguines massives et de distinguer les cellules tumorales malignes des globules blancs et des globules rouges.

2) Au cours des explorations passées, un grand nombre de techniques spécialisées d'isolement des CTC ont été développées qui, pour l'essentiel, peuvent être divisées en deux grandes catégories : ① les cellules qui capturent les CTC sur la base de l'expression d'antigènes spécifiques (sélection positive) ; ② celles qui consomment toutes les cellules non CTC (sélection négative).

L'une des techniques classiques de sélection cellulaire (sélection positive) des CTC repose sur une procédure en deux étapes : la première étape implique la centrifugation de l'échantillon pour éliminer les composants plasmatiques, tandis que les CTC sont capturés à l'aide d'un ferrofluide magnétique conjugué à la molécule d'adhésion des cellules épithéliales (EpCAM) ; dans la deuxième étape, les CTC putatifs ont été colorés et identifiés à l'aide d'un anticorps anti-cytokératine, tandis que les globules blancs (WBC) contaminants ont été identifiés par coloration CD45. Les progrès de la technologie de séquençage unicellulaire facilitent également l'analyse moléculaire d'échantillons cellulaires de CTCs uniques rares.

3) CTCs individuels et groupes de CTCs. Un groupe de CTC est défini comme un groupe de deux CTC ou plus avec des jonctions cellule-cellule stables passant ensemble dans le sang. Comparés aux CTC individuels, les groupes de CTC présentent des profils d'expression génétique et des schémas de dissémination distincts. L'analyse du transcriptome a montré que les groupes de CTC conservaient des caractéristiques épithéliales. Les jonctions cellule-cellule peuvent jouer un rôle clé dans la formation et le maintien du système circulatoire. À l'heure actuelle, la recherche connexe sur les amas de CTC bat son plein.

1）L'ADNc est généralement un fragment d'ADN activement sécrété par les cellules tumorales ou libéré dans la circulation pendant l'apoptose ou la nécrose des cellules tumorales, avec une longueur de 132-145 pb et une demi-vie courte (généralement <2 h). L'ADNc porte des caractéristiques génétiques dérivées des cellules tumorales, telles que la mutation, la méthylation, l'amplification ou le réarrangement des gènes, et peut être utilisé comme un indicateur important pour le dépistage des tumeurs, le diagnostic compagnon, l'évaluation de l'efficacité du traitement et la stratification du risque pronostique. La biopsie liquide est une méthode peu invasive permettant de visualiser la somme d'ADNc dans les sites tumoraux primaires et secondaires. Non seulement la quantité d'ADNc peut être quantifiée, mais les changements génétiques peuvent également être identifiés. Des mutations spécifiques dans des gènes ont été identifiées dans le plasma de plusieurs types de patients cancéreux, ce qui fait de l'ADNc un biomarqueur possible du cancer. Cependant, il n'est pas facile d'obtenir des concentrations d'ADNc détectables dans les fluides corporels, et les fragments d'ADNc ont une courte demi-vie.。

Le consensus d'experts sur la pratique clinique du séquençage à haut débit de l'ADNc en 2022 a souligné : Avec le développement rapide de la biopsie liquide, il est possible d'utiliser les fluides corporels pour analyser les caractéristiques moléculaires des patients, en particulier à haut débit sur la base de l'ADN tumoral circulant (ctDNA). La technologie de séquençage de nouvelle génération (NGS) est de plus en plus utilisée en clinique en raison de ses avantages : non invasive ou peu invasive, temps de détection court, capacité à refléter l'hétérogénéité intratumorale et métastatique, et suivi dynamique de l'efficacité thérapeutique.

a.Des facteurs tels que le type de tissu pathologique tumoral, la localisation, le stade et la charge tumorale peuvent affecter la libération d'ADNc. Les niveaux d'ADNc sont généralement plus faibles chez les patients dont les tumeurs ont une charge tumorale plus légère, des sites spécifiques (par exemple, les tumeurs intracrâniennes) et des histologies spécifiques (par exemple, les gliomes), et dont les niveaux de prolifération, d'apoptose et de vascularisation sont plus faibles.

Par rapport à l'analyse histologique, l'analyse de l'ADNc présente les avantages d'un prélèvement non invasif ou peu invasif, d'un échantillonnage répété et d'un délai court pour la collecte, le traitement et les rapports d'analyse. L'ADNc plasmatique a également augmenté le taux de détection des mutations des gènes conducteurs par rapport à la biopsie tissulaire seule. Cependant, par rapport aux échantillons de tissus, la teneur en ADNc dans le sang périphérique est plus faible, ce qui est susceptible d'entraîner des résultats faussement négatifs dans les tests cliniques. Le fait de ne pas utiliser les leucocytes comme contrôle peut également conduire à des résultats faussement positifs dus à une variation germinale ou à des mutations hématopoïétiques clonales. En outre, il existe également des différences dans la quantité d'ADNc libérée dans le sang entre différents patients atteints de tumeurs ou chez le même patient à différents moments, ce qui entraîne également des difficultés pour la détection et l'interprétation cliniques de l'ADNc.

2 Application de l'ADNc dans les diagnostics compagnons. Les diagnostics compagnons (CDx) sont considérés comme un outil indispensable de la médecine personnalisée des tumeurs, qui exige que les informations fournies par les résultats des tests soient suffisantes pour garantir la sécurité et l'efficacité des médicaments thérapeutiques correspondants. Les patients qui bénéficient d'un traitement spécifique. La première application clinique de la détection de l'ADNc en tant que CDx a été la détection de la mutation du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), qui a été principalement utilisée pour identifier les patients atteints de CBNPC avancé qui pourraient bénéficier des TKI de l'EGFR.

Dans l'étude ENSURE, l'ADNc a détecté les mutations 19del et L858R de l'EGFR avec une spécificité de 98,2 % et une sensibilité de 76,7 % ; et les patients traités par erlotinib sur la base des résultats de l'ADNc ont présenté une SSP significativement améliorée par rapport aux patients sous chimiothérapie. Sur la base des résultats de cette étude, la FDA a approuvé le premier produit CDx de biopsie liquide, Cobas EGFR Mutation Test v2, en 2016, puis l'Administration nationale des produits médicaux (NMPA) en 2019 pour approuver le lancement national de ce produit CDx. Dans l'étude FLAURA, le taux de réponse objective (ORR) des patients ctDNA T790M-positifs à l'osimertinib était cohérent avec celui des patients ayant une biopsie tumorale positive. Cela a ouvert une vague de points chauds de recherche dans la détection de l'ADNc dans la maladie résiduelle minimale (MRD) et le déficit de recombinaison homologue (HRD).

3 Points clés de la technologie de détection NGS de l'ADNc. La phase intermédiaire de l'analyse comprend deux étapes : "l'expérience humide" et "l'expérience sèche". l'"expérience humide" comprend l'extraction des acides nucléiques, la conception et la synthèse des amorces ou des sondes, la préparation de la bibliothèque, le séquençage embarqué, etc. La préparation de la bibliothèque peut choisir la capture par hybridation ou l'amplification. Le contrôle de la qualité de cette étape doit établir des exigences correspondantes en matière de concentration d'acide nucléique, de pureté et de distribution des fragments lors de l'extraction de l'acide nucléique et se conformer à la mise en œuvre. L'"expérience sèche" couvre chaque étape du processus d'analyse bioinformatique, et le contrôle de qualité de cette étape doit porter sur la profondeur de séquençage minimale, la profondeur de séquençage moyenne, l'uniformité de la couverture, la teneur en guanine et en cytosine (GC), la valeur de qualité de l'appel de base, la comparaison de la valeur de qualité et le taux de ciblage, etc. La phase de post-analyse comprend l'interprétation du rapport de test, la discussion au sein du conseil de la tumeur moléculaire (MTB) et le conseil génétique

Stratégies de construction de librairies Les stratégies de séquençage ciblé pour la détection de l'ADNc à l'aide de méthodes NGS sont principalement divisées en deux types : la méthode NGS basée sur la capture hybride (hybrid capture NGS) et la méthode NGS basée sur l'amplification (amplification-based NGS). La méthode NGS ciblée basée sur la capture hybride est une méthode dans laquelle la sonde de capture s'hybride à une région spécifique du génome pour obtenir et analyser la séquence de la région cible. Cette méthode comporte de nombreuses étapes opérationnelles, et le processus est relativement compliqué. Il faut 1~2 jours pour terminer la construction de la bibliothèque et passer à l'ordinateur. Elle peut détecter les mutations ponctuelles, les insertions et délétions de petits fragments et les variations du nombre de copies, ainsi que les réarrangements de gènes au niveau de l'ADN, et certaines fusions inconnues peuvent être trouvées. la sensibilité de détection peut atteindre plus de 95 %. Les sondes utilisées dans la construction de la bibliothèque de la méthode de capture de la séquence cible sont conçues avec des sondes d'ADN et des sondes d'ARN, principalement pour l'enrichissement ciblé de la région cible, pour assurer l'enrichissement complet de la séquence cible de l'échantillon, pour améliorer l'efficacité de l'enrichissement et l'uniformité de la couverture, et pour réduire efficacement le coût du séquençage. Les approches NGS ciblées basées sur les amplicons reposent sur de multiples étapes d'amplification par PCR pour enrichir les séquences cibles. Au cours des expériences, le temps de manipulation réel pour la préparation de la bibliothèque basée sur l'amplification est généralement plus court que pour les méthodes de capture hybride. Quelle que soit la méthode utilisée, il convient de définir des critères clairs pour les librairies admissibles pour chaque essai.

L'émergence de la biopsie liquide est l'amélioration du système existant de détection des tumeurs. La biopsie liquide peut détecter des traces de tumeurs dans le corps à un stade précoce, et constitue une méthode importante pour le dépistage précoce des tumeurs. En outre, par rapport à la biopsie tissulaire directement prélevée sur le tissu tumoral, le matériau de la biopsie liquide est dérivé du sang, ce qui est moins invasif et pratique pour le suivi en temps réel. L'effet positif est une technologie importante de diagnostic et de traitement des tumeurs.

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