Brève discussion sur la technologie PCR quantitative par fluorescence en temps réel

Brève discussion sur la technologie PCR quantitative par fluorescence en temps réel

À l'heure actuelle, en fonction des différents produits chimiques fluorescents utilisés dans la PCR quantitative fluorescente en temps réel, la technologie de la PCR quantitative fluorescente est principalement divisée en deux catégories, à savoir les colorants fluorescents et les sondes fluorescentes. Les colorants fluorescents sont une méthode de détection non spécifique des séquences amplifiées et sont les premières méthodes utilisées dans la PCR quantitative par fluorescence. Les sondes fluorescentes sont une technologie de PCR quantitative par fluorescence basée sur le principe du transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET).

Colorant fluorescent

La méthode du colorant fluorescent est également connue sous le nom de coloration de liaison à l'ADN. Les colorants de liaison à l'ADN sont les premiers produits chimiques utilisés dans la PCR quantitative par fluorescence. La principale molécule de colorant actuellement utilisée est le SYBR Green I. Le SYBR Green I peut se lier spécifiquement au sillon mineur des doubles brins d'ADN. Le SYBR Green I libre n'émet pratiquement aucun signal de fluorescence, mais après s'être lié à l'ADN, son signal de fluorescence peut être multiplié par des centaines de fois. Par conséquent, plus il y a de produits amplifiés par PCR, plus le SYBR Green Ⅰ est lié, et plus le signal de fluorescence est fort [1], ce qui permet de quantifier n'importe quel gène cible.

le principe de base du SYBR GreenⅠluminosité

Sonde d'hydrolyse

Les sondes d'hydrolyse sont représentées par les sondes TaqMan, également connues sous le nom de sondes d'exonucléase. La technologie TaqMan est une sorte de technologie PCR quantitative fluorescente en temps réel, étudiée et développée par la société américaine PE en 1996, et elle a été largement utilisée pour la détection quantitative de gènes [2,3]. Le principe de base consiste à utiliser l'activité exonucléase 5' de l'enzyme Taq, c'est-à-dire que l'enzyme Taq possède une activité exonucléase 5'-3' naturelle, qui peut couper les nucléotides à l'extrémité 5' de l'ADN double brin et libérer un acide oligonucléotidique unique.

▲Basic principle of TaqMan

▲Comparaison des avantages et des inconvénients des méthodes

Principes techniques des produits SpaceGen :

Après une série de transformations, la cytosine (C) non méthylée peut être convertie en uracile (U). Après une réaction PCR, l'uracile (U) est finalement converti en thymine (T), c'est-à-dire en cytosine (C) non méthylée. La pyrimidine (C) sera finalement convertie en thymine (T) ; la cytosine (C) méthylée ne changera pas au cours de la réaction de modification en raison de l'effet protecteur de son groupe méthyle, c'est-à-dire que la cytosine (C) méthylée est convertie en cytosine (C).

Les produits de détection de la méthylation de SpaceGen utilisent la technologie PAP-ARMS® pour compléter la détection quantitative par PCR fluorescente du génome modifié et combinent la réaction d'activation par hydrolyse du pyrophosphate sur le principe de la technologie ARMS traditionnelle. La méthode de la sonde TaqMan et le processus expérimental d'extraction d'acide nucléique, de modification de la méthylation et de PCR en fluorescence ont été utilisés pour la détection.

Références

1、Proc Nat Acad Sci USA，1996，93：14509-14514.

3、Clin Chem Lab Med，1998，36：587-588.

4、Nat Genet，1993，4（3）：289-294.